Mit dieser Methode kann die Toxizität neuer ophthalmologischer Produktformulierungen in vitro bewertet werden. Durch die Verfeinerung der Konzentrationen von Chemikalien und Produktformulierungen unter Verwendung von Augenzellen in vitro kann der Einsatz von Tieren zur Beurteilung der Sicherheit neuer Produkte minimiert werden. In-vitro-Assays bewerten Toxizitätsendpunkte, die in vivo nicht bewertet werden können, wie z. B. die Bestimmung der Wirkung einer Chemikalie auf die mitochondriale Funktion, die Integrität der Zellmembran und die Enzymaktivität.
Die Bewertung der Zelltoxizität in vitro ist der Schlüssel zum Verständnis potenzieller Toxizitätsmechanismen. Dies ist wichtig, um eine maximal tolerierbare Dosis therapeutischer Chemikalien im Auge zu erreichen. Das Verfahren wird von Nijani Nagaarudkumaran, einem Forscher des Jones Laboratory, demonstriert.
Beginnen Sie damit, sowohl pHCECs als auch iHCECs auf kollagenbeschichtete Petrischalen mit Deckgläsern mit Glasboden in einer Konzentration von 1 x 10 bis 5 mit 1 Milliliter humanem Augenepithelmedium (HOEM) zu setzen. Züchten Sie pHCECs und iHCECs, 1 Satz Kulturen für 24 Stunden und ein weiteres Set für 48 Stunden in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation werden die Zellen mit 500 Mikrolitern Annexin-Färbepufferlösung, die 4 mikromolare Calcein, 8 mikromolare Ethidiumhomodimer 1 und Annexin 5 enthält, 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius gefärbt.
Nachdem Sie die Zellen gefärbt haben, stellen Sie das konfokale Laser-Scanning-Mikroskop so ein, dass es die Anregungs- und Emissionswellenlängen erfasst, wie im Textmanuskript beschrieben. Besorgen Sie sich die zweidimensionalen und dreidimensionalen Bilder gemäß den Anweisungen im Manuskript. Die Zellen werden mit 5 x 10 bis 4 pro Milliliter HOEM in jede Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte ausgesät und bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid 3 Stunden lang inkubiert.
Nach der Inkubation wird das Volumen des Mediums in den Vertiefungen auf 300 Mikroliter reduziert. Als nächstes setzen Sie die Zellen in separaten Experimenten 5 und 20 Minuten lang UVA-Strahlung mit 6,48 Watt pro Quadratmeter und UVB-Strahlung mit 1,82 Watt pro Quadratmeter bei 37 Grad Celsius aus. Nach UV-Bestrahlung 200 Mikroliter frisches HOEM in jede Vertiefung geben und 20 Stunden bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid inkubieren.
Am nächsten Tag wird der Zellüberstand in jeder Vertiefung gesammelt und in sterile 2-Milliliter-Polypropylenröhrchen umgefüllt. Den Überstand bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Um die Zytokinspiegel zu bestimmen, die von den pHCECs und iHCECs nach UV-Exposition freigesetzt werden, verwenden Sie einen Multiplex-Zytokin-Assay und befolgen Sie die Anweisungen des Kits zur Quantifizierung von Interleukin 6, Interleukin 8, Interleukin-1 beta und TNF-alpha.
Bereiten Sie ein 10%metabolisches Assay-Reagenz in DMEM und F12 vor. Ersetzen Sie das Nährmedium in jeder Vertiefung durch 1 Milliliter der 10%igen metabolischen Assay-Lösung und inkubieren Sie es bei 37 Grad Celsius mit 5%Kohlendioxid für 4 Stunden. Messen Sie die Fluoreszenz jeder Lösung mit einem Fluoreszenzplatten-Lesegerät bei 530 Nanometern Anregung und 590 Nanometern Emissionswellenlänge.
Samenzellen bei 5 x 10 bis zum Viertel pro Milliliter HOEM in jeder Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte. Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid 3 Stunden inkubieren. Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und setzen Sie die Zellen 5 und 15 Minuten lang 1 Milliliter chemischen Toxinen aus, zu denen 0,001 % Benzalkoniumchlorid oder BAK, 0,01 % Wasserstoffperoxid und 0,0025 % Natriumdodecylsulfat in PBS gehören.
Entfernen Sie nach dem Kontakt mit den chemischen Toxinen die Giftstoffe aus den Vertiefungen, spülen Sie sie mit 1 Milliliter PBS ab und geben Sie 1 Milliliter HOEM in jede Vertiefung. Führen Sie nach 20 Stunden Inkubation einen metabolischen Assay durch, indem Sie das Medium durch 1 Milliliter einer 10%igen metabolischen Assay-Lösung ersetzen und 4 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 5%igem Kohlendioxid inkubieren. Messen Sie die Fluoreszenz jeder Lösung mit einem Fluoreszenzplatten-Lesegerät bei einer Anregung von 530 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 590 Nanometern.
Nach der 20-stündigen Inkubation werden die Zellüberstände aus den Vertiefungen in separate sterile 2-Milliliter-Polypropylenröhrchen überführt und bei minus 80 Grad Celsius eingefroren. Verwenden Sie dieselbe Multiplex-Plattform, die zur Bestimmung der Zytokine aus den UV-behandelten Zellen verwendet wird, gemäß den Anweisungen des Kits zur Quantifizierung von Interleukin 6, Interleukin 8, Interleukin-1 beta und TNF-alpha. Samenzellen bei 1 x 10 bis 5 pro Milliliter HOEM in jede Vertiefung einer 24-Well-Kollagen-1-beschichteten Kulturplatte und inkubieren bei 37 Grad Celsius mit 5%Kohlendioxid für 24 Stunden.
Entfernen Sie nach der Inkubation das Medium und setzen Sie die Zellen 5 Minuten lang 1 Milliliter chemischen Toxinen aus, einschließlich 0,001 % BAK, 0,005 % BAK und 0,01 % BAK in PBS. Entfernen Sie nach der Exposition die chemischen Giftstoffe, spülen Sie die Vertiefungen mit 1 Milliliter PBS aus und geben Sie 1 Milliliter HOEM in jede Vertiefung. Nach 20 Stunden Inkubation werden die Zellen mit 500 Mikrolitern Annexin-Färbepufferlösung, die Calcein, Ethidiumhomodimer und Annexin 5 enthält, 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius gefärbt.
Stellen Sie das Mikroskop so ein, dass Intensitäten bei Anregungs- und Emissionswellenlängen von 630 und 675 Nanometern für Annexin 5, 495 und 515 Nanometer für Calcinein AM und 528 und 617 Nanometer für die Ethidium-1-Färbung gemessen werden. Nehmen Sie dann mit dem Fluoreszenzmikroskop Bilder der Zellen auf. Es stellte sich heraus, dass es sich bei den iHCECs um kleine Zellen handelte, die zwischen 10 und 20 Mikrometer groß waren, und die pHCECs lagen nach 24 Stunden Wachstum im Bereich von 20 bis 50 Mikrometern.
Ähnliche Unterschiede im Größenbereich wurden für iHCECs und pHCECs nach 48 Stunden Wachstum beobachtet. Im Vergleich zu den nicht UV-exponierten Zellen war die Stoffwechselaktivität der bestrahlten pHCECs nach 20 Minuten Exposition signifikant reduziert. Bei iHCECs nahm die metabolische Aktivität für Zellen, die sowohl nach 5 als auch nach 20 Minuten bestrahlt wurden, ab.
Daher dauerte es eine längere Expositionszeit, um die metabolische Aktivität der pHCECs zu reduzieren als die der iHCECs. Die maximale Zytokinfreisetzung durch die iHCECs lag bei 5 Minuten UV-Exposition. Die maximale Zytokinfreisetzung für pHCECs erfolgte bei 20 Minuten UV-Exposition.
Gemessen an der Gesamtmenge der freigesetzten inflammatorischen Zytokine setzten die pHCECs wesentlich mehr Interleukin-1 beta, Interleukin 8 und TNF-alpha frei als die iHCECs, während die iHCECs mehr Interleukin 6 freisetzten. Sowohl pHCECs als auch iHCECs zeigten eine Veränderung in der Freisetzung von Interleukin 6 nach Exposition gegenüber allen drei Chemikalien. BAK verursachte eine Abnahme der Freisetzung von Interleukin 6 im Vergleich zur Kontrollgruppe sowohl für primäre als auch für immortalisierte HCECs.
Wasserstoffperoxid bewirkte eine erhöhte Freisetzung von Interleukin 6 aus iHCECs und eine Abnahme der Freisetzung aus pHCECs. Sowohl pHCECs als auch iHCECs waren mit 0,005 % und 0,1 % des BAK signifikant geschädigt. Nach der Durchführung von In-vitro-Bewertungen der Toxizität von Augenzellen könnten weitere Tiermodelle zur Augentoxizität durchgeführt werden, um die Wirkung eines Augenprodukts auf die Hornhautnerven oder das okuläre Immunsystem zu bestimmen.
Diese Techniken sind unerlässlich, um die Mechanismen der Toxizität von Chemikalien und Produktformulierungen für das Auge zu bestimmen, und tragen dazu bei, den Einsatz von Tieren für Produktentwicklungstests zu minimieren.
