Diese Methode passt das Metataral-Kulturprotokoll an größere Knochen an, so dass direkte Knochenmanipulationen mit komplexen genetischen Modellen kombiniert werden können, um Prozesse im Zusammenhang mit der Knochenentwicklung anzugehen. Diese Technik ermöglicht manipulations- und Analyse des Knochenwachstums, die in vivo nicht möglich sind, wie z. B. Live-Bildgebung oder direkte physikalische und pharmakologische Manipulation. Diese ex vivo-Kulturmethode ermöglicht die spezifische Untersuchung der lokalen Auswirkungen des genetischen Einfalls in den Knochen, das ihn von der systemischen Wirkung der Behandlung auf den Organismus trennt.
Beginnen Sie mit der Sterilisation des Bauchbereichs eines schwangeren Schwangerschaftstages 14,5 bis 18,5 Maus mit 80% Ethanol und mit einer kleinen Schere, um die Haut und Bauchmuskeln zu öffnen, um die Gebärmutterhörner zugreifen. Um die Gebärmutter aus der Bauchhöhle zu extrahieren, entfernen Sie das Mesometrium und schneiden Sie die Basis der Hörner. Dann die Gebärmutter auf eine 60-Millimeter-Petrischale mit eiskaltem Dissektionsmedium auf Eis übertragen.
In einem Biosicherheitsschrank mit Schere zwischen die Säcke geschnitten, um die einzelnen Föten zu trennen, und einen einzelnen Sack in eine neue 60-Millimeter-Schale mit frischem Seziermedium unter einem Sezier-Stereomikroskop zu übertragen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Föten von den Plazenta zu trennen und die Föten von den Membranen zu reinigen. Verwenden Sie eine getrimmte Kunststoffpipette, um den Körper in eine neue 60-Millimeter-Schale zu übertragen, und enthaupten Sie den Embryo vor der weiteren Zerlegung.
Dann verwenden Pinzette, um die Haut zu entfernen, beginnend von hinten und Peeling bis zu den Zehen. Verwenden Sie die Pinzette, um in der Nähe der Wirbelsäule zu schneiden und trennen Sie die Hinterbeine vom Körper. Die Hinterbeine auf eine saubere Schale mit eiskaltem Dissektionsmedium übertragen und die Pinzette zwischen den Oberflächenknorpel des distalen Oberschenkelknochens und der proximalen Tibia einsetzen, um die Tibia vom Oberschenkelknochen zu trennen.
Entfernen Sie die Hüftknochen aus dem proximalen Oberschenkelknochen und dem Calcaneus-Knochen und der Fibel von der Tibia. Ziehen Sie die Weichteile vorsichtig aus den Oberschenkelknochen und Tibias und tragen Sie eine sterile Ein-Milliliter-Pipette, um alle vier Beinknochen in den ersten Brunnen einer 24-Well-Platte mit frischem Seziermedium zu übertragen. Es ist wichtig zu zeigen, dass das Weichgewebe, das den Puls des Knochens verbindet, entfernt wird.
Andernfalls wird sich der Knochen biegen und nicht das richtige Wachstum erreichen. Wenn die Knochen von der entsprechenden experimentellen Anzahl von Föten seziert wurden, stellen Sie die Knochen in jedem Brunnen manchmal Null unter einem Lichtmikroskop mit einem guten Kontrast und ersetzen Sie das Seziermedium in jedem Brunnen mit einem Milliliter Kulturmedium pro Brunnen, wobei besonders darauf geachtet wird, die Knochen nicht zu saugen. Um die Wirkung der Wachstumshemmung in den Kulturbedingungen zu beobachten, behandeln Sie die linken Tibias mit 500 Nanomolar-Retinsäure und inkubieren Sie die rechten Tibias mit einem entsprechenden Fahrzeugvolumen als Kontrolle.
Legen Sie die Platte dann unter Standard-Zellkulturbedingungen in einen Zellkultur-Inkubator. Nach zwei Tagen behandeln Sie die Knochen mit einem geeigneten Thymidin-Analogfür für ein bis zwei Stunden, um die Knochenzellproliferation zu bewerten, bevor Sie die Knochen 10 Minuten lang in einzelne Zwei-Milliliter-Röhren mit 4%Paraformaldehyd übertragen. Übertragen Sie dann die Knochen auf PBS, um die Knochen am letzten Zeitpunkt abzubilden, bevor Sie die Proben zur nächtlichen Fixierung bei vier Grad Celsius an das Paraformaldehyd zurückgeben.
Um die Länge und die mineralisierte Region der Knochen zu messen, öffnen Sie ein geeignetes Bildgebungssoftwareprogramm und messen Sie unter Berücksichtigung der Skala des Bildes sowohl die Gesamtlänge des Knochens als auch die mineralisierte Region. Beginnen der Messungen von den ersten dunklen Zellen an einem Ende bis zu den letzten dunklen Zellen am anderen Ende. Um die Wachstumsrate zu berechnen, die als durchschnittliche Erhöhung der Länge pro Tag definiert ist, teilen Sie die Differenz zwischen der enddauernden Länge des Knochens und der Anfangslänge durch die Anzahl der Tage in der Kultur.
Hier wird ein Vergleich zwischen kultiviertem Tibia und frisch extrahiertem Tibia in gleichwertigen Stadien gezeigt. Nach bis zu zwei Tagen Kultur ist die erreichte Größe vergleichbar mit dem in vivo Knochenwachstum sowohl für den Knorpel als auch für den mineralisierten Knochen. Längere Kulturperioden führen zu größeren Unterschieden zwischen den kultivierten Knochen und den frisch extrahierten Knochen.
Beachten Sie, dass die Tibia, die mit einer unvollständigen Entfernung des Weichgewebes gewachsen ist, zur Beugung der kultivierten Tibia führen kann. Die Behandlung mit Retinsäure wirkt sich bereits nach zwei Behandlungstagen robust auf das tibiale Wachstum aus. Obwohl die Gesamtlänge der Tibia nach zwei Tagen in der Kultur konstant zunimmt, entspricht dieses Wachstum einem ungefähren Anstieg von nur neun bis 29 % gegenüber der ursprünglichen Länge.
Weniger als das Knochenwachstum, das in vivo beobachtet werden würde. Tatsächlich zeigt die analoge Thymidin-Etikettierung in dieser Region nach kultur weniger positive Zellen als frisch extrahierte Knochen in einem gleichwertigen Stadium. Darüber hinaus nimmt die Gesamtlänge des Skelettelements bei in vitro kultivierten Tibia erheblich zu, während in der mineralisierten Region fast kein Anstieg beobachtet wird.
Neben der histologischen und molekularen Analyse können Clearing und 3D-Bildgebung nach der Kultur durchgeführt werden, um die zelluläre Wirkung der Behandlungen zu charakterisieren, die auf die kultivierten Knochen angewendet werden. Die Technik ermöglicht es uns, Fragen im Zusammenhang mit der interorganalen Kommunikation zu beantworten. Zum Beispiel durch die Ko-Kultivierung von Knochen aus den verschiedenen genetischen Modellen in einer Art schmerzfreiem Parabiose-Experiment.
