Dieses Protokoll beschreibt unsere mikrofluidische Akustophorese-Technologie, die für die schnelle und effiziente Trennung gramnegativer Bakterien aus einem Medium mit Aptamer-modifizierten Mikrokügelchen verwendet werden kann. Mikrofluidische Akustophorese-Systeme ermöglichen die gramnegative Bakterientrennung mit angemessenem Durchsatz und berührungsloser Zellisolierung. Die mikrofluidische Akustophorese kann optimiert werden, um Bakterien aus medizinischen und Umweltproben zu isolieren.
Entwerfen Sie zunächst einen mikrofluidischen Akustophorese-Chip, der PS-Kügelchen am Zielausgang sammelt und den Rest verwirft, nachdem eine PS-Probenmischung in den Probeneingang injiziert wurde. Bereiten Sie einen Chip vor, bei dem die Schichten über und unter der Siliziumschicht mit dem Borosilikatglas verbunden sind. Und eine dritte Borosilikatglasschicht mit Eloxierung fügt 1000 Volt und 400 Grad Celsius hinzu.
Befestigen Sie eine PZT auf der Borosilikatglasschicht entlang des mikrofluidischen Kanals mit weniger als 10 Mikrolitern Cyanacrylatkleber. Impfen Sie die GN- und GP-Bakterien in Luria-Bertani-Medium und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius und 220 Umdrehungen pro Minute für 16 Stunden. Zentrifugieren Sie die kultivierten Bakterien bei 9, 056 RCF für eine Minute bei Raumtemperatur.
Anschließend zweimal mit 1X PBS Puffer waschen. Bereiten Sie die ausgewählten GN- und GP-Bakterien für die Analyse vor, indem Sie sie im Bindungspuffer resuspendieren. Resuspendieren Sie die 10 Mikrometer Streptavidin-beschichtete Mikroperlenmischung vor Gebrauch.
Wirbeln Sie die Mischung für 20 Sekunden. Bereiten Sie das Aptamer vor, indem Sie es drei Minuten lang bei 95 Grad Celsius denaturieren und dann bei null Grad Celsius für zwei Minuten wieder falten. 250 Mikroliter der resuspendierten Streptavidin-beschichteten Mikroperlenmischung in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen und 100 Mikroliter biotinyliertes DNA-Aptamer in die Röhre geben.
Inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für 30 Minuten, während Sie mit 25 Umdrehungen pro Minute drehen. Zentrifugieren Sie das Reaktionsgemisch bei 9, 056 RCF für 40 Sekunden bei Raumtemperatur. Anschließend waschen Sie das Röhrchen zweimal mit 200 Mikrolitern Tris-HCl-Puffer.
10 Mikroliter 100 Milligramm BSA pro Milliliter in das gewaschene Probenröhrchen geben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, während sie mit 25 Umdrehungen pro Minute rotieren. Schließlich waschen Sie die Aptamer-modifizierten Mikroperlen zweimal in Tris-HCl-Puffer durch Zentrifugation bei 9.056 RCF für 40 Sekunden bei Raumtemperatur. Verbinden Sie PEEK-Röhrchen mit den beiden Einlässen für die Injektion von zwei Proben und Puffer sowie den beiden Auslässen zum Sammeln und Entladen von Abfällen.
Füllen Sie den mikrofluidischen Akustophoresekanal mit blasenfreiem demineralisiertem Wasser mit einer 10-Milliliter-Spritze. Bereiten Sie einen Präzisionsdruckregler mit zwei oder mehr Ausgangskanälen vor, um den Flüssigkeitsfluss zu steuern. Nach der Vorbereitung des Geräts injizieren Sie die Probe und den Puffer, indem Sie mit dem Präzisionsdruckkontrollgerät einen Druck von zwei Kilopascal auf den Probeneingang und vier Kilopascal auf den Puffereinlass ausüben.
Fokussieren Sie mit einem Mikroskop auf eine Perle und bewegen Sie sie mit dem PZT in die Mitte des mikrofluidischen Kanals. Erzeugen Sie eine Resonanzfrequenz von 3,66 Megahertz mit einem einkanaligen Funktionsgenerator und verstärken Sie ein typisches Signal mit einem Leistungsverstärker um 16 Dezibel. Beobachten Sie die Trenn- und Anreicherungsprozesse auf dem akustofluidischen Chip mit einem Fluoreszenzmikroskop und einer Hochgeschwindigkeitskamera, die mit 1.200 Bildern pro Sekunde arbeitet.
Der in dieser Studie vorgestellte akustophoretische Chip bestätigte, dass mit zunehmender Spannung des PZT die zentrale Konzentration der 10 Mikrometer großen Perlen zunahm. Bei fünf Volt der PZT-Spannung konzentrierten sich die meisten der 10 Mikrometer großen Perlen in der Mitte. Das Verhältnis der Anzahl der am Auslass gesammelten Perlen zur Gesamtzahl der injizierten 10 Mikrometer großen Perlen wurde als Wiederfindungsrate bezeichnet.
Das Verhältnis der Anzahl der 10 Mikrometer großen Perlen zur Gesamtzahl der gesammelten Perlen wurde als Reinheit bezeichnet. Die Ergebnisse zeigten, dass das Gerät eine hohe Trennleistung für Perlen mit einer Größe von 10 Mikrometern hatte. Die Anzahl der GN- und GP-Bakterien, die an jede Aptamer-modifizierte Mikroperle gebunden sind, wurde mit einem Mikroskop mit einer Hochgeschwindigkeitskamera gemessen.
Alle fünf GN-Bakterien waren an die Perlen gebunden, während deutlich weniger GP-Bakterien an die getesteten Substanzen gebunden waren. Die Signalstärke unterschied sich signifikant zwischen den GN- und GP-Bakterien. Der Klebstoff, der zur Befestigung des PZT verwendet wird, sollte so wenig wie möglich für die Genauigkeit der Riffelung verwendet werden und PZT und Mikrokanal sollten parallel sein.
Dieses Gerät kann verwendet werden, um lebende Bakterien oder von Bakterien abgeleitete Biomarker in der Zeit der Früherkennung von bakteriellen Infektionskrankheiten nachzuweisen.
