Dieses Protokoll hebt die wichtigsten Schritte zur Amplifikation, Differenzierung und Kryokonservierung primärer nasales Epithelzellen hervor. Unter unseren Kulturbedingungen ahmen primäre Nasenepithelzellen das Lungenepithel nach. Dies ermöglicht patientenabgeleitete Kulturen und personalisierte Medizinstudien aus frischen oder biobankierten Zellen.
Die vom Patienten abgeleiteten nasalen Epithelkulturen können verwendet werden, um die CFTR-Aktivität zu bewerten und bei der Mukoviszidose-Therapie zu helfen, indem die individuelle Reaktion des Patienten auf neue Therapien bewertet wird. Das Verfahren wird Aurelie Hatton, eine Ingenieurin aus meinem Labor, demonstrieren. Züchten Sie zunächst nasale Epithel- oder HNE-Zellen in 10 Millilitern Amplifikationsmedium.
Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in einem 75 Quadratzentimeter großen kollagenbeschichteten Kolben, bis er 80 bis 90% Konfluenz erreicht. Wechseln Sie das Medium alle 48 bis 72 Stunden. Später waschen Sie die Zellen mit 10 Millilitern Magnesium und kalziumfreiem DPBS.
Saugen Sie die Kochsalzlösung ab und entsorgen Sie sie. Bevor Sie zwei Milliliter 0,25% Trypsin zugeben und den Kolben für acht bis 12 Minuten in den Inkubator zurückbringen. Klopfen Sie später mit einer Handfläche fest auf den Kolben, um die Zellablösung zu unterstützen.
Fügen Sie 10 Milliliter des Amplifikationsmediums hinzu, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Spülen Sie den Kolben kräftig mit einer 10-Milliliter-Pipette ab, um das Verstärkungsmedium über die Kolbenoberfläche zu ziehen und auszustoßen, um Zellen zu spülen und zu lösen und die Zellen in einem 15-Milliliter-Rohr zu sammeln. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 500 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand.
Suspendiert das Pellet in fünf bis 10 Milliliter Verstärkungsmedium erneut. Zählen Sie dann die Zellen auf einem Hämozytometer. Nach der Zellzählung zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand.
Dann suspendieren Sie das Pellet wieder in das angereicherte Gefriermedium, um drei- bis fünfmal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter zu erhalten, und legen Sie es in eine Kryo-Durchstechflasche. Langsam frieren Sie die Zellen ein, indem Sie die Temperatur in einem geeigneten Kryogefrierbehälter bei minus 80 Grad Celsius um etwa ein Grad Celsius pro Minute senken. Am nächsten Tag bringen Sie die konservierte Probe zur Langzeitlagerung in einen Stickstofflagerbehälter.
Das frisch zubereitete Verstärkungsmedium in einem Wasserbad auf 37 Grad Celsius erwärmen. Entfernen Sie Kryo-Fläschchen aus dem Stickstoffspeichertank und legen Sie sie schnell in das Wasserbad, wobei Sie darauf achten, die gesamte Durchstechflasche nicht in Wasser zu tauchen. Entfernen Sie die Kryo-Fläschchen aus dem Wasserbad, wenn nur noch ein kleiner gefrorener Tröpfchen übrig ist.
Wischen Sie die Fläschchen mit 70% Alkohol ab und legen Sie sie unter die Haube. Übertragen Sie die aufgetauten Zellen mit einer Ein-Milliliter-Pipette in ein 15-Milliliter-Rohr. Dann fügen Sie einen Milliliter warmes Verstärkungsmedium tropfenweise hinzu.
Fügen Sie nach einer Minute einen weiteren Milliliter Verstärkungsmedium hinzu und warten Sie eine Minute. Fügen Sie 10 Milliliter Verstärkungsmedium hinzu und zentrifugieren Sie bei 500 mal G für zwei Minuten bei vier Grad Celsius. Saugen Sie den Überstand auf und verwerfen Sie ihn.
Resuspendiert das Pellet in einem Volumen von Verstärkungsmedium, das erforderlich ist, um eine Zelldichte von eins mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter zu erreichen. Nach dem Aussäen der Zellen auf einen 25 Quadratzentimeter großen, mit Kollagen beschichteten Kolben, der Amplifikationsmedium enthält, inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Beobachten Sie die Zellexpansion visuell über zwei bis drei Tage, bevor Sie eine Zellamplifikation durchführen, wie bereits gezeigt.
Säen Sie die Zellen in einer Dichte von 3,3 mal 10 bis fünf Zellen pro Filter auf 0,33 Quadratzentimeter kollagenbeschichteten porösen Filtern, ergänzt mit 300 Mikrolitern Amplifikationsmedium auf der apikalen Seite und 900 Mikrolitern Luftflüssigkeitsmedium auf der basolateralen Seite. Nach drei Tagen aspirieren Sie das apikale Medium und kultivieren Sie die Zellen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche für drei bis vier Wochen im Luft-Flüssig-Medium, um ein differenziertes Epithel zu etablieren. Wechseln Sie das Basalmedium alle 48 bis 72 Stunden.
Frische HNE-Zellen, die an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche kultiviert wurden, zeigten typische Merkmale des polarisierten und differenzierten respiratorischen Epithels. In den 78 HNE-Zellproben wurden die Erfolgsraten beim Nasenbürsten sofort und nach ein bis sieben Tagen Transport in einem Spülmedium verglichen. Der anfängliche durchschnittliche Prozentsatz der erfolgreichen Kulturen betrug 82% und erreichte 87% in Proben, die zwischen null und fünf Tagen ausgesät wurden.
83% der Proben, die sich unter frischen Bedingungen erfolgreich differenzierten, waren auch in kryokonservierten Proben erfolgreich. In ähnlicher Weise waren bei Proben, die sich unter frischen Bedingungen nicht differenzieren konnten, 71% auch bei Frost-Tau-Bedingungen erfolglos. Darüber hinaus wuchsen 50% der Proben, die zwischen zwei und drei Mal 10 bis zu den sechs Zellen pro Kryo-Durchstechflasche gefroren waren, nicht, wenn sie aufgetaut wurden, und erreichten 80% für unter zwei mal 10 zu den sechs Zellen.
Für die Kurzschlussstromänderung als Reaktion auf Forskolin und die Kurzschlussstromänderung als Reaktion auf den CFTR-Inhibitor 172 in DMSO-behandelten HNE-Zellen wurde kein signifikanter Unterschied zwischen frischem oder gefrorenem aufgetautem HNE beobachtet. Bei der Behandlung zeigten beide Zelltypen eine signifikante Korrektur mit einer Zunahme der Kurzschlussstromänderung als Reaktion auf Forskolin und einer Abnahme der Kurzschlussstromänderung als Reaktion auf den CFTR-Inhibitor 172. Das korrigierende Ansprechen von CFTR-Funktionsdualtherapien wurde im Vergleich zu DMSO-behandelten HNE-Zellen untersucht, die Kurzschlussstromänderung als Reaktion auf Forskolin und als Reaktion auf den CFTR-Inhibitor 172 wurde sowohl durch VX-809 plus VX-770 als auch durch VX-661 plus VX-770 signifikant verbessert.
Drei verschiedene CFTR-Modulator-Therapien in HNE von sechs F508del-homozygoten Patienten wurden verglichen. Bei Verwendung in Kombination mit einem CFTR-Korrektor und -Potentiator, sowohl Vertex- als auch CFTR-Modulatoren, korrigierte die Kurzschlussstromänderung als Reaktion auf Forskolin und die Kurzschlussstromänderung als Reaktion auf den CFTR-Inhibitor 172 in ähnlichem Maße. Beim Einfrieren von HNE-Zellen ist es wichtig, mindestens 3 Millionen Zellen pro Kryo-Durchstechflasche zu haben, um die Chancen auf ein gutes Ergebnis beim Auftauen zu erhöhen.
Es hat sich gezeigt, dass die CFTR-Aktivität in HNE-Zellen ein gutes Vorhersagemodell ist, um personalisierte Therapien bei Mukoviszidose zu bewerten und anzupassen.
