Diese Methode erwirbt lebende Scheiben des Hörhirnstamms des Huhns, der einen größeren Gradienten der Frequenzregion in derselben Scheibe umfasst. Diese Scheiben eignen sich für elektrophysiologische und anatomische Experimente mit einer größeren tonotopischen Achse. Diese Methodik wird helfen, die Entwicklung von Mikroschaltkreisen im auditorischen Hirnstamm zu verstehen.
Während die Anatomie spezifisch für das Huhn ist, haben andere Vogelarten wie Wachteln und Singvögel eine ähnliche Anatomie. Um zu beginnen, sterilisieren Sie die Eier mit 70% Ethanol und inkubieren Sie sie bei 38 Grad Celsius und 50% Feuchtigkeit. Als nächstes stellen Sie die Sprudelrate für den ACSF so ein, dass der pH-Wert 7,2 bis 7,4 mit einer Osmolalität zwischen 300 und 310 Milliosmolar pro Liter beträgt.
Dann mischen Sie fünf Gramm Agarose in 100 Milliliter dACSF. Lösen Sie die Agarose vollständig mit einem Wasserbad oder einer Mikrowelle auf, bis die Agarose zu sprudeln beginnt. Die geschmolzene Agarose bis zu einer Dicke von fünf Millimetern in eine Petrischale gießen und bei Raumtemperatur festhalten lassen.
Nach dem Abbinden die Petrischale verschließen und bei vier Grad Celsius lagern. Schneiden Sie die Agarose in Kabinenblöcke zur Verwendung zum Zeitpunkt der Dissektion. Reinigen Sie zuerst den Dissektionsbereich mit 70% Ethanol.
Kleben Sie den tragenden oder abgewinkelten Agaroseblock auf die Vibratomschale. Legen Sie das Ei unter ein helles Licht und suchen Sie den luftgefüllten Raum auf der größeren oder runderen Seite des Eies, dann knacken Sie die Schale über dem luftgefüllten Raum und legen Sie den Membransack frei. Machen Sie einen sanften Schnitt in den Sack, um den Schnabel freizulegen.
Ziehen Sie mit einem Skalpell Hals und Kopf vorsichtig aus dem Ei. Reinigen Sie den Kopf nach der Enthauptung mit gekühltem dACSF. Halten Sie den Kopf ruhig in gekühltem dACSF und machen Sie einen rostrocaudalen Einschnitt.
Beginnen Sie den Schnitt hinter und zwischen den Augen und folgen Sie der Länge des geernteten Halses. Trennen Sie die Haut, um den Schädel freizulegen. Schneiden Sie den Schädel hinter dem Auge in Mittellinie bis seitliche Richtung.
Wiederholen Sie diesen Vorgang für beide Hemisphären. Schneiden Sie den rostralen Teil des Schädels, indem Sie die Klinge hinter die Augen legen und einen schnellen Schnitt machen. Dann tauchen Sie den Kopf in eine Schüssel mit gekühltem dACSF.
Machen Sie mit einer kleinen Schere Mittellinien- bis Seitenschnitte in der kaudalen Region des Schädels, um das Gehirn zu trennen, ohne Gewebeschäden zu verursachen. Legen Sie den Hirnstamm und das Kleinhirn vorsichtig frei. Ziehen Sie den dorsalen Bereich des gesamten Schädels zurück.
Entfernen Sie den Hirnstamm und belichten Sie ihn durch leichtes Pinseln mit einem feinen Pinsel. Verwenden Sie gebogene Pinzetten, um den Hirnstamm von Verbindungsgewebe und Blutgefäßen zu reinigen. Trennen Sie den Hirnstamm vom Kleinhirn, indem Sie die Stiele schneiden und die Blutgefäße vorsichtig entfernen.
Schneiden Sie den Hirnstamm zusätzlicher Blutgefäße ab. Platzieren Sie zunächst die Vibratomklinge entlang der horizontalen Achse. Für koronale Scheiben kleben Sie den Hirnstamm auf ein Schneidetablett an der Rostralseite, wobei die rostrocaudale Achse vertikal gehalten wird.
Halten Sie bei sagittalen Schnitten die laterale mediale Achse vertikal. Kleben Sie bei horizontalen Scheiben die ventrale Seite und halten Sie die dorsale ventrale Achse vertikal. Um die akute winkelige sagittale horizontale Ebene zu erreichen, kleben Sie die ventrale Seite des Hirnstamms so, dass die ventrale dorsale Achse vertikal auf dem Hypotenuse-Oberflächenagarosenblock liegt.
Kleben Sie die gegenüberliegende Oberfläche des Agaroseblocks zur Schneideschale hin und halten Sie die Rostrocades parallel zur Klingenkante. Als Alternative zum Vibratomschneiden tauchen Sie den isolierten Hirnstamm in 4% niedrige Schmelzpunktagarose bei 40 Grad Celsius in eine 35 x 10 Millimeter große Petrischale. Nachdem die Agarose erstarrt ist, schneiden Sie den Kabinen-Agaroseblock mit einer scharfen Rasierklinge.
Kleben Sie den Agaroseblock auf seine rostrale Seite und halten Sie die rostrocaudale Achse des Hirnstamms vertikal. Nehmen Sie koronale Schnitte, bis die NM-Region zu sehen ist. Entfernen Sie den Agaroseblock mit einer scharfen Klinge vom Kleber.
Legen Sie mit einer feinen Nadel vorsichtig 0,5 Mikroliter Toluidinblau-Farbstoff auf die NM, um die Kerne zu erkennen. Montieren Sie diesen Block wieder auf der Schneideschale für sagittale oder horizontale Scheiben. Identifizieren Sie die Kerne in Bezug auf die gefärbte Region und schneiden Sie den Hirnstamm.
Nach dem Schneiden legen Sie die 200 bis 300 Mikrometer nacheinander gesammelten Scheiben in eine geschnittene Kammer, die ACSF enthält, um eine Stunde lang bei Raumtemperatur zu babribrieren. Koronale Schnitte des Hirnstammgewebes von einem E19- bis 21-Hühnerembryo stellen die relativen Isofrequenzregionen der auditorischen Hirnstammkerne von der niedrigsten zur höchsten charakteristischen Hörfrequenzregion dar. Die afferenten Hörnervenfasern und die Gabelung der NM-Axone waren sichtbar.
Nucleus angularis wurde ebenfalls beobachtet. In rostralen Abschnitten befindet sich der obere Olivarkern entlang der ventralen lateralen Region der koronalen Scheibe. In sagittalen Abschnitten wurden NM und Nucleus laminaris oder NL identifiziert, wo die Hörnervenfasern in den Cluster von Neuronen eintraten.
Der obere Olivarkern wurde in der rostrolateralen Region identifiziert. Es wurden nieder- und hochfrequente Hörregionen aus NM und NL entlang der rostrocaudalen Achse beobachtet. Der medialste Schnitt zeigte die ipsilateralen und kontralateralen axonalen Büschel und den Endpunkt der Hörregion.
In den horizontalen Schnitten wurden NM und NL in Richtung der Mittellinie identifiziert, und Neuronen waren entlang der lateralen medialen Achse verteilt. Schnitte des Hirnstammgewebes in einem spitzen Winkel von einer horizontalen Ebene zeigten die auditorischen Hirnstammkerne über eine große diagonale Ausbreitung. Vergrößerte Bilder zeigten die tonotopische Achse der Hörkerne entlang der rostromedialen bis caudolateralen Achse.
Stellen Sie sicher, dass der gesamte Prozess in eisgekühltem dACSF durchgeführt wird, das kontinuierlich mit Kohlenhydratsauerstoff geblasen wird. Dieses Protokoll wird für Forscher verwendet, die die anatomischen und biophysikalischen Eigenschaften der Entwicklung von Hirnstamm-Mikroschaltkreisen untersuchen, insbesondere die Beziehung zwischen den wichtigsten Hörkernen.
