Die von der Darmmikrobiota freigesetzten Metaboliten erzeugen komplexe Wirkungen auf den Wirt. Dieses Protokoll stellt eine Methode vor, um die Rolle von Darmmetaboliten im Gehirn und Verhalten der Maus zu hinterfragen. Diese Technik bietet eine präzise, sorgfältige und validierte Methode, um Darmmetaboliten in frei beweglichen Mäusen in ein Gehirn zu bringen.
Wir bieten eine umfassende und physiologisch beste Methodik für Einblicke in die Darm-Hirnachsenforschung. Setzen Sie die Maus auf den stereotaktischen Rahmen und befestigen Sie die Mausschneidezähne an der Schneideleiste im stereotaktischen Schneidezahnhalter. Bedecken Sie die Nase mit der Nasenkegelmaske.
Beurteilen Sie dann die Nozizeption der Maus über den oberen Quetschreflex und stellen Sie eine konstante Atemfrequenz sicher, bevor Sie die Operationsstelle einschneiden. Sobald das Fell auf dem Kopf durch das Klebeband entfernt wird, injizieren Sie subkutan das Analgetikum Ketoprofen, um Schmerzen zu lindern, und tragen Sie Augensalbe auf. Als nächstes fixieren Sie den Kopf, indem Sie den spitzen Ohrbügel in den Gehörgang einführen.
Ziehen Sie die Nasenklemme am Schneidezahnhalter fest und drücken Sie den Kopf vorsichtig, um sicherzustellen, dass der Kopf fixiert ist. Verwenden Sie 3 abwechselnde Peelings Chlorhexidin-Tupfer, um die Kopfhaut zu desinfizieren. Verwenden Sie nun das sezierende Skalpell, um einen Schnitt von weniger als einem Zentimeter in der Kopfhaut auf vordere posteriore Weise zu machen.
Nach dem Öffnen des Einschnitts wischen Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen ab, das von einer Mikrosezierzange gehalten wird. Identifizieren und beschriften Sie anhand der stereotaktischen Koordinaten die Position des rechten lateralen Ventrikels, wie im Manuskript beschrieben. Als nächstes bohren Sie ein Loch durch den Schädel an der markierten Stelle mit einem stereotaktischen Bohrer und später zwei bis vier weitere Löcher in den Schädel.
Wischen Sie den Schädel mit einem Lidocain-Wattestäbchen ab und montieren Sie 2 bis 4 Edelstahlschrauben an den Löchern. Legen Sie die handelsübliche Führungskanüle auf den stereotaktischen Kanülenhalter und desinfizieren Sie sie mit dem Glasschnellsterilisator bei 150 Grad Celsius. Bewegen Sie dann den stereotaktischen Kanülenhalter zu dem für den Seitenventrikel gebohrten Loch und führen Sie die handelsübliche Führungskanüle langsam in das Loch ein, bis die gewünschte Tiefe erreicht ist.
Tragen Sie nun 10 Mikroliter n-Butylcyanacrylat-Klebstoff auf, um die handelsübliche Führungskanüle im Bohrloch zu fixieren und warten Sie 3 bis 4 Minuten. Lassen Sie die handelsübliche Führungskanüle vorsichtig vom stereotaktischen Kanülenhalter los und tragen Sie Zahnacryl auf die eingeschnittene Kopfhaut auf, um die handelsübliche Führungskanüle zu fixieren, und warten Sie mindestens 5 Minuten. Implantieren Sie den handelsüblichen Dummy in die handelsübliche Führungskanüle.
Dann setzen Sie die Maus in einen neuen Käfig mit einem Heizkissen darunter, um sich von der Anästhesie zu erholen, und beobachten Sie kontinuierlich, bis die Maus vollständig erwacht. Montieren Sie die Mikroliterspritze mit 10 Mikrolitern destilliertem Wasser auf der Mikroinjektionspumpe. Füllen Sie das Polyethylenröhrchen mit destilliertem Wasser und verbinden Sie die Mikroliterspritze mit dem hängenden Polyethylenröhrchen.
Schalten Sie den Mikroinjektionscontroller ein und drücken Sie Alle Kanäle anzeigen, um auf den Befehlsbildschirm zuzugreifen. Als nächstes drücken Sie die Konfiguration und setzen Sie das Volumenziel auf 9.800 Nanoliter mit einer Förderrate von 100 Nanolitern pro Sekunde. Dann drücken Sie die Richtung, um in den Infusionsmodus zu wechseln, und drücken Sie den Lauf, um 9.800 Nanoliter destilliertes Wasser aus dem Polyethylenrohr zu infundieren, das mit der Mikroliterspritze verbunden ist.
Legen Sie nun den Injektor in ein Fläschchen mit dem Mineralöl, drücken Sie die Konfiguration und stellen Sie das Volumenziel auf 3.000 Nanoliter mit einer Förderrate von 100 Nanolitern pro Sekunde ein. Um 3.000 Nanoliter Mineralöl zu entnehmen, drücken Sie die Richtung, um in den Entnahmemodus zu wechseln, und drücken Sie dann auf Laufen. Zerlegen Sie den Polyethylenschlauch von der Mikroliter-Spritzennadel.
Um 3.000 Nanoliter destilliertes Wasser aus der Mikroliter-Spritzennadel auszuspucken, drücken Sie die Richtung, um in den Infusionsmodus zu wechseln und den Lauf zu drücken. Führen Sie dann die Mikroliterspritze wieder in das Polyethylenröhrchen ein. Setzen Sie den Injektor in eine Durchstechflasche mit SCFAs ein.
Pressenkonfiguration und Volumenziel auf 9.500 Nanoliter mit Förderrate auf 100 Nanoliter pro Sekunde einstellen. Ziehen Sie 9.500 Nanoliter SCFAs ab, indem Sie die Richtung drücken, um in den Entnahmemodus zu wechseln und auf Lauf zu drücken. Beschriften Sie die Öl-SCFAs-Phase, um zu validieren, ob die SCFAs erfolgreich infundiert wurden.
Drücken Sie die Konfiguration und stellen Sie das gewünschte Volumenziel mit Fördermenge auf 7 Nanoliter pro Sekunde ein. Drücken Sie die Richtung, um in den Infusionsmodus zu wechseln. Drücken Sie Run, um die Mikroliterspritze nach vorne zu infundieren, bis die Flüssigkeit am vorderen Ende des kommerziellen Injektors austritt, bevor Sie den Injektor in die Kanüle für die SCFA-Injektion einführen.
Nach der Betäubung der Maus führen Sie den kommerziellen Injektor in die kommerzielle Führungskanüle ein. Sobald die Maus aus der Narkose erholt ist, legen Sie sie in einen neuartigen Käfig und lassen Sie sie 35 Minuten lang frei erkunden. Infusion von SCFAs mit einer Lieferrate von 7 Nanolitern pro Sekunde für ein Zielvolumen von 2.100 Nanolitern in den ersten 5 Minuten.
Drücken Sie dann Richtung in den Infusionsmodus und drücken Sie Ausführen. Entfernen Sie nach dem Verhaltenstest den kommerziellen Injektor aus der kommerziellen Führungskanüle. Infusion von 2.100 Nanolitern des neutralen Tracers mit einer Abgaberate von 7 Nanolitern pro Sekunde, um die Infusionsstelle zu verifizieren.
Bilden Sie das Fluoreszenzsignal an der Infusionsstelle mit einem Fluoreszenzmikroskop ab. Sowohl ACSF- als auch SCFAs-infundierte Mäuse reisten insgesamt 35 Minuten lang in einem neuartigen Käfig. Es wurde kein Unterschied in der Bewegungsaktivität im neuartigen Käfig zwischen der Infusion von SCFAs und ACSF beobachtet.
Der Fluoreszenzfarbstoff wurde im lateralen Ventrikel und den umliegenden Regionen des Mausgehirns nachgewiesen, wenn er mit einer handelsüblichen Führungskanüle infundiert wurde. In ähnlicher Weise führt die Infusion durch die Edelstahl-Führungskanüle zur Detektion von Signalen im lateralen Ventrikel und den umliegenden Regionen des Mausgehirns. Die Kombination dieses Verfahrens mit schaltkreisbasierten neuronalen Technologien wird es Wissenschaftlern ermöglichen, Einblicke in die schaltkreisbasierte Kontrolle des Gehirns und das Verhalten zu gewinnen, das von Darmmetaboliten beigetragen wird.
Diese Technik ebnet den Forschern den Weg, die Rolle von Mikrobiota und Metaboliten in der komplizierten Darm-Hirnachse zu erforschen.
