Dieses Protokoll erkennt präzise Chromosomenfaltungsmerkmale über mehrere Längenskalen mit einem niedrigen Hintergrundsignal. So können beispielsweise Promotor-Enhancer-Interaktionen im Kontext von Chromosomenkompartimenten analysiert werden. Durch die Verwendung von Restriktionsendonukleasen wird die Optimierung des Verdauungsniveaus des Eingangsmaterials umgangen.
Es ist keine Auswahl durch Gelisolierung erforderlich, um Ligationsprodukte zu erfassen. Das häufigste Problem ist der Verlust von Zellen nach DSG-Fixierung und der Erfassung von genügend DNA, um qualitativ hochwertige Bibliotheken zu produzieren. Um zu beginnen, saugen Sie das Medium mit einer Pasteur-Pipette gekoppelt an eine Vakuumfalle von der 150-Millimeter-Platte mit 5 x 10 zu den sechsten Zellen ab.
Waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 Milliliter HBSS. Um die Zellen zu vernetzen, gießen Sie 23,125 Milliliter der 1%igen Formaldehydlösung in die 15-Zentimeter-Platte. Bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubieren und die Platte alle zwei Minuten vorsichtig von Hand schaukeln.
Als nächstes fügen Sie 1,25 Milliliter 2,5-molares Glycin hinzu und schwenken Sie die Platte vorsichtig, um die Vernetzungsreaktion zu löschen, bevor Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Setzen Sie die Inkubation auf Eis für 15 Minuten fort, um die Vernetzung zu beenden. Schaben Sie die Zellen mit einem Zellschaber oder Gummipolizisten von der Platte ab und geben Sie die Zellsuspension mit einer Pipette in ein 50-Milliliter-konisches Röhrchen.
Zentrifugieren Sie die Suspension bei 1.000 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur und verwerfen Sie den Überstand durch Aspiration. Waschen Sie das Pellet einmal mit 10 Milliliter Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder DPBS. Dann zentrifugieren Sie erneut, bevor Sie mit der DSG-Vernetzung fortfahren.
Zur Vernetzung mit DSG resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 9,9 Milliliter DPBS. Dann fügen Sie 100 Mikroliter 300-Millimolar-DSG hinzu. Mischen Sie das Rohr durch Inversion und vernetzen Sie die Zellen bei Raumtemperatur für 40 Minuten auf einem Rotator.
Nach der Vernetzung 1,925 Milliliter 2,5-molares Glycin hinzufügen, zum Mischen invertieren und fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen bei 2.000 mal G für 15 Minuten und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter 0,05% Rinderserumalbumin DPBS, bevor Sie es in ein 1,7-Milliliter-Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 2.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen Sie den Überstand.
Frieren Sie das Pellet in flüssigem Stickstoff ein, bevor Sie mit der Chromosomenbestätigung fortfahren. Resuspendieren Sie das vernetzte Zellaliquot in einem Milliliter eiskaltem Lysepuffer, der 10 Mikroliter Proteaseinhibitor-Cocktail enthält, und überführen Sie es für 15 Minuten Inkubation auf Eis in einen Dounce-Homogenisator. Bewegen Sie Stößel A langsam 30 Mal auf und ab, um die Zellen zu homogenisieren, und inkubieren Sie für eine Minute, damit die Zellen vor weiteren 30 Schlägen abkühlen können.
Nach dem letzten Hub das Lysat in ein 1,7-Milliliter-Röhrchen überführen. Zentrifugieren Sie die lysierte Suspension bei 2.500 mal G für fünf Minuten. Verwerfen Sie den Überstand und streichen Sie oder Wirbel, um das nasse Pellet zu resuspendieren.
Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, um eine joghurtähnliche Substanz mit minimalen Klumpen zu erhalten. Resuspendieren Sie das Pellet vor der Zentrifugation in 500 Mikroliter eiskaltem Restriktionspuffer. Nach dem zweiten Waschgang wird das Pellet in 360 Mikroliter Restriktionspuffer durch Pipettieren resuspendiert, nachdem das Verschleppungsvolumen des Pellets je nach Zellgröße um ca. 340 Mikroliter erhöht wurde.
Legen Sie 18 Mikroliter Lysat beiseite, um die Chromatinintegrität zu testen, oder CI.To Sie das verbleibende Lysat, fügen Sie 38 Mikroliter 1% Natriumdodecylsulfat zu Hi-C-Röhrchen hinzu, um ein Gesamtvolumen von 380 Mikrolitern zu erhalten, und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren ohne Blaseneinführung. Inkubieren Sie die Proben bei 65 Grad Celsius ohne Schütteln für 10 Minuten, um das Chromatin zu öffnen. Dann legen Sie die Tube sofort auf Eis.
Nach der Zubereitung der Aufschlussmischung mit Triton X-100 107 Mikroliter dieser Mischung in das Hi-C-Rohr geben, um ein Gesamtvolumen von 487 Mikrolitern zu erhalten, und das Chromatin über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Thermomixer mit Intervallschütteln verdauen. Am nächsten Tag werden die Proben für 20 Minuten auf 65 Grad Celsius überführt, um die verbleibende Endonukleaseaktivität zu deaktivieren. Nachdem Sie die Probe auf Eis gelegt haben, legen Sie 10 Mikroliter Verdauungskontrolle (DC) beiseite und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius.
Entfernen Sie das Kondenswasser mit einer Pipette oder durch Schleudern vom Deckel. Dann fügen Sie 58 Mikroliter Biotin-Füllmischung hinzu, um ein Gesamtvolumen von 535 Mikrolitern zu erhalten. Pipettieren Sie vorsichtig, ohne Blasen zu bilden, bevor Sie vier Stunden lang bei 23 Grad Celsius in einem Thermomixer inkubieren.
Nach der Inkubation fügen Sie 665 Mikroliter Ligationsmischung hinzu, so dass das Probenvolumen 1, 200 Mikroliter beträgt. Die Probe wird durch Pipettieren gemischt und vier Stunden lang bei 16 Grad Celsius in einem Thermomischer inkubiert. Als nächstes werden 50 Mikroliter Proteinase-K in zwei Fraktionen in das Hi-C-Probenröhrchen gegeben und über Nacht bei 65 Grad Celsius mit Intervallschütteln inkubiert.
Für die DNA-Reinigung fügen Sie 100% eiskaltes Ethanol hinzu und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 18.000 mal G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand vollständig von der Nichtpelletseite und trocknen Sie die Probe 10 Minuten lang an der Luft oder bis die Pellets sichtbar trocken sind. Sobald die Pellets trocken sind, lösen Sie sie in 450 Mikroliter Tris low-EDTA durch Pipettieren oder Wirbeln.
Die gelöste Suspension wird in eine 0,5-Millimeter-Zentrifugalfiltereinheit (CFU) mit einer Molekulargewichtsgrenze von drei Kilodaltonnen überführt. Zentrifugieren Sie die KBE 10 Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit und verwerfen Sie den Durchfluss. Nach dem zweiten Waschgang 80 Mikroliter Tris Low-EDTA in die Säule geben.
Verwandeln Sie die Säule in ein neues Sammelrohr für zwei Minuten Zentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit. Zum Schluss laden Sie die Proben auf ein 0,8%iges Agarose-Gel. Agarose-Gel mit PCR-Titrationsergebnissen zeigte, dass die meisten Bibliotheken fünf bis acht Zyklen der endgültigen PCR-Amplifikation benötigen.
Der Zellverdau der endgültigen amplifizierten PCR-Bibliothek, wie er von kleineren Fragmenten auf einem Agarosegel beobachtet wird, bestätigt das Vorhandensein geeigneter Ligationsverbindungen und dient als Qualitätskontrolle vor der Sequenzierung. Nach der Sequenzierung zeigten die abgebildeten Daten, dass die Kombination von DpnII und DdeI die Kurzstreckenkontakte signifikant erhöht, da DSG zur konventionellen Formaldehydvernetzung hinzugefügt wird. Ein verbessertes Signal konnte auch auf lange und kurze Entfernungen direkt aus 2D-Interaktionsmatrizen beobachtet werden.
Kompartimentsignale sind CRISPR auf große Entfernungen und Punkte, die durch Chromatinschleifen gebildet werden, sind bei kurzen Entfernungen stärker ausgeprägt. Zusätzlich zu Formaldehyd verringert die Vernetzung mit DSG die zufälligen Ligaturen und verbessert die relative Abdeckung in cis. Es ist wichtig, während und nach der Vernetzung keine Zellen zu verlieren.
Zellpellets können lose oder unsichtbar sein, und Zellen können in einigen der Puffer an Pipettenspitzen haften.
