Die Nucleus Hi-C-Protokolle ermöglichen die Erforschung der Chromosomenbestätigung mit unterschiedlicher Auflösung für die Charakterisierung von Chromatinschleifen, Domänen und Kompartimentorganisationen des Genoms. Dieses Protokoll bietet eine hochauflösende Profilierung genomischer Interaktionen auf verschiedenen Skalen und liefert eine konsistentere Abdeckung über den gesamten Bereich genomischer Entfernungen und Daten mit weniger technischem Rauschen. Die Kombination dieses Protokolls mit der genetischen Bearbeitung ist eine leistungsstarke Strategie, um die strukturelle Funktion genetischer Elemente zu testen.
Es kann auch zur Charakterisierung von strukturellen Variationen angewendet werden, die zu Krankheiten führen. Das Nucleus Hi-C-Protokoll kann angewendet werden, um die Genomorganisation eines eukaryotischen Genoms zu untersuchen. Durch die SDS- und Triton-Behandlung werden alle Kernklumpen durch Pipettieren disaggregiert, da Aggregate die enzymatische Reaktionseffizienz beeinträchtigen, und stellen Sie sicher, dass Sie vor der Sequenzierung die entsprechenden Qualitätskontrollen durchführen.
Beginnen Sie mit der Zugabe von methanolfreiem Formaldehyd zu einmal 10 zu den sieben Schneider's Line 2 Plus Drosophila-Zellen in 17,5 Millilitern Schneider-Medium, ergänzt mit 10% FBS zu einer Endkonzentration von 2%Inkubieren Sie die Zellen für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit Mischen alle 60 Sekunden oder auf einem rotierenden Rad und fügen Sie Glycin zu einer Endkonzentration von 0,125 Molar mit Mischen hinzu. Nach fünf Minuten bei Raumtemperatur und 15 Minuten auf Eis die Zellen durch Zentrifugation sammeln und das Pellet vorsichtig in 25 Milliliter kaltem PBS resuspendieren und die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation sammeln. Am Ende der Zentrifugation resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter eiskaltem Lysepuffer zum Zählen und stellen Sie die Zellen auf eine einmalige Konzentration von 10 bis sechs Zellen pro Milliliter ein.
Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang auf Eis und kehren Sie die Röhre alle zwei Minuten um, um die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation zu mischen und zu sammeln. Das Pellet in einem Milliliter frischer eiskalter Lysepuffer wieder auffüllen. Nach der Zentrifugation das Lysat mit einem Milliliter 1,25-fachem Restriktionspuffer waschen.
Zentrifugieren Sie erneut, um das Lysat zu sammeln. Das Pellet in 360 Mikroliter frischem Restriktionspuffer und 11 Mikrolitern 10% SDS mit sorgfältigem Pipettieren wieder aufwirbeln und 45 Minuten bei 37 Grad Celsius und 7 bis 950 Umdrehungen pro Minute mit gelegentlichem Pipettieren inkubieren. Stoppen Sie am Ende der Inkubation die Permeabilisierung mit 75 Mikrolitern nichtionischem Tensid und geben Sie das Röhrchen für weitere 45 Minuten mit Schütteln bei 950 Umdrehungen pro Minute bei gelegentlichem Pipettieren in den Inkubator zurück.
Für den Chromatinaufschluss 200 Einheiten Mbo1 in die Röhre geben, um eine vier- bis 16-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius mit Rotation zu erreichen. Am Ende der Inkubation inaktivieren Sie das Enzym mit 20-minütiger Inkubation bei 60 Grad Celsius. Um die Restriktionsfragmentüberhänge zu füllen und die DNA-Enden mit Biotin zu kennzeichnen, fügen Sie jeweils 1,5 Mikroliter mit 10 millimolaren dCTP, dGTP, dTTP, 20 Mikrolitern mit 0,4 millimolarem Biotin dATP, 17,5 Mikroliter Tris-Puffer mit niedrigem EDTA-Anteil und 10 Mikrolitern mit fünf Einheiten pro Mikroliter DNA-Polymerase ein großes Fragment unter sorgfältigem Mischen in die Tube hinzu.
Inkubieren Sie die Reaktion für 75 Minuten bei 37 Grad Celsius mit Schütteln bei 700 Umdrehungen pro Minute alle 10 Sekunden für 30 Sekunden. Am Ende der Inkubation die Ligationsmischung zum Chromatin geben und mit gründlichem, schonendem Mischen auf ein Milliliter Endreaktionsvolumen einstellen und über Nacht bei 16 Grad Celsius inkubieren. Um die Probenproteine abzubauen, fügen Sie 50 Mikroliter von 10 Milligramm pro Milliliter Proteinase K für eine zweistündige Inkubation bei 37 Grad Celsius in das Röhrchen hinzu.
Erhöhen Sie am Ende der Inkubation die Temperatur über Nacht auf 65 Grad Celsius, um die Vernetzung der Probe umzukehren. Am nächsten Morgen bauen Sie die RNA mit 10 Mikrolitern von 10 Milligramm pro Milliliter RNAse A ab.Nach einer Stunde bei 37 Grad Celsius ein Volumen Phenolchloroform in das Röhrchen geben und gründlich durch Inversion mischen, um eine homogene Weißphase zu erhalten. Nach der Ausfällung der DNA nach Standardprotokollen quantifizieren Sie die DNA mit einem fluorogenen Farbstoff, der selektiv an DNA bindet, und einem Fluorometer gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Um die DNA von unverdauten und verdauten Aliquoten zu reinigen, laden Sie 100 Nanogramm unverdaute, verdaute und ligierte Proben auf ein 1,5% iges Agarosegel und suchen Sie nach einem Abstrich, der um 500 Basenpaare in der verdauten Probe zentriert ist, im Vergleich zu einem hochmolekularen Band für die ligierte Probe. Um die Hi-C-Markierung und Ligationseffizienz durch Amplifikation und Aufschluss einer bekannten Wechselwirkung zu überprüfen, verdauen Sie die Produkte nach der PCR mit Mbo1, Cla1 oder beidem und führen Sie die Proben auf einem neuen 1,5 bis 2% Gel aus, um die relative Anzahl der 3C- und Hi-C-Ligationsübergänge abschätzen zu können. Nach der Beschallung der Probe, um 200 bis 500 Basenpaar-DNA-Fragmente zu erhalten, werden 130 Mikroliter mit fünf Mikrogramm DNA aus jeder Probe in neue Mikrozentrifugenröhrchen mit 16 Mikrolitern 10X Ligationspuffer, zwei Mikrolitern 10 Millimolar dATP, fünf MikroliterN T4-DNA-Polymerase und sieben Mikroliter doppelt destilliertem Wasser für eine 30-minütige Inkubation bei 20 Grad Celsius übertragen.
Am Ende der Inkubation werden fünf Mikroliter 10 Millimolar-dNTPs, vier Mikroliter 10X-Ligationspuffer, fünf Mikroliter T4-Polynukleotidkinase, ein Mikroliter DNA-Polymerase, ein großes Fragment und 25 Mikroliter doppelt destilliertes Wasser für eine zweite 30-minütige Inkubation bei 20 Grad Celsius in die Röhrchen geben. Um Fragmente meist im Größenbereich von 250 bis 550 Basenpaaren auszuwählen, führen Sie eine sequenzielle Festphasen-Reversible- und Mobilisierungsgrößenauswahl mit 0,6X, dann 0,9X gemäß den Anweisungen des Herstellers durch und eluieren Sie die DNA mit 100 Mikrolitern Tris Low EDTA. Für den Biotin-Pulldown für jede Bibliothek waschen Sie 150 Mikroliter Streptavidin-gebundene magnetische Perlen zweimal mit 400 Mikrolitern 1X Tween-Puffer und drehen Sie die Proben drei Minuten lang auf einem rotierenden Rad.
Am Ende der Inkubation die Perlen in 300 Mikroliter 2X no Tween-Puffer wieder aufsetzen und mit 300 Mikrolitern Hi-C-Material für eine 30-minütige Rotation auf einem rotierenden Rad mischen. Am Ende der Inkubation waschen Sie die Perlen mit 400 Mikrolitern 0,5X Tween-Puffer für eine dreiminütige Inkubation bei 55 Grad Celsius und 750 Umdrehungen pro Minute, gefolgt von zwei Wäschen in 200 Mikrolitern mit 1X Restriktionspuffer pro Waschgang. Nach der zweiten Wäsche die Perlen in 100 Mikroliter dATP-Bergemischung für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius wieder aufsetzen.
Am Ende der Inkubation die Perlen in 50 Mikroliter 1X Ligationspuffer resuspendieren und die Suspension in ein neues Röhrchen mit vier Mikrolitern vorgeglühten gepaarten Endadaptern und zwei MikroliterN T4-Ligase übertragen. Entfernen Sie nach zwei Stunden bei Raumtemperatur den Überstand und waschen Sie die Perlen zweimal mit 400 Mikrolitern Tween-Puffer, dann waschen Sie die Perlen einmal mit 200 Mikrolitern ohne Tween-Puffer und einmal mit 100 Mikrolitern Restriktionspuffer, bevor Sie die Perlen in 40 Mikrolitern 1X-Restriktionspuffer wieder aufhängen. Ein Abstrich von 200 bis 1.000 Basenpaaren wird beobachtet, wenn die Restriktion mit Mbo1 erfolgreich ist.
Wenn die Ligatur erfolgreich ist, wird ein hochmolekulares Band an der Oberseite des Gels beobachtet. Die Aufschlusseffizienz kann auch durch quantitative PCR bestätigt werden. Eine akzeptable Verdauungseffizienz beträgt 80% oder höher.
Wie dargestellt, kann die Amplifikation einer bekannten Mittelbereichsinteraktion in Hi-C-Ligationsprodukten durch Aufschluss des bei der Amplifikation gewonnenen PCR-Produkts abgeschätzt werden. Eine Verdauungseffizienz von mehr als 70% wird empfohlen, um einen großen Anteil an nicht nützlichen Lesevorgängen für die Bibliotheken nach der Sequenzierung zu vermeiden. Die Anzahl der PCR-Zyklen für die endgültige Amplifikation sollte einen Zyklus kleiner sein als die Anzahl der Zyklen, für die der Abstrich sichtbar ist.
Der Grad der Verdauung der Bibliothek zeigt die Fülle der gültigen Hi-C-Paare an und spiegelt den Anteil der nützlichen Lesevorgänge wider, die aus der Bibliothek erhalten werden. Mit den eindeutig gültigen Hi-C-Paaren kann eine grundlegende Analyse der Paarverteilung durchgeführt werden. Wie in diesem repräsentativen Beispiel beobachtet, kann der NOTCH-Genlocus zusammen mit den architekturellen Proteinen, den Domänen eins und zwei und Histonmodifikationen entlang des Locus gesehen werden.
Bei der Deletion der Region, die sowohl die CTCF- als auch die M1BP-DNA-Bindungsstellen enthält, kann eine dramatische Veränderung der Chromatinkontakte beobachtet werden. Nach dem Hi-C-Experiment kann ein experimentiert werden, um einen bestimmten Satz von Kontakten zu erreichen, z. B. aus Promotorregionen. Dies ist besonders nützlich bei der Beurteilung großer Genome.
Wie gezeigt, kann die Kombination des Hi-C-Protokolls mit genetischer Addition verwendet werden, um die strukturelle und regulatorische Funktion genomischer Elemente zu bewerten.
