Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es hochauflösende Chromosomenschleifen und andere kurzreichweitige Interaktionsmerkmale zeigt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Kartierung der 3D-Genomorganisation mit Nukleosomenauflösung und hohem Signal-Rausch-Verhältnis. Um die MNase-Titration durchzuführen, tauen Sie ein Pellet von eins mal 10 bis zur sechsten Zelle 10 Minuten lang auf Eis auf, resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern DPBS und inkubieren Sie die Zellsuspension 20 Minuten lang auf Eis.
Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 10.000 G für fünf Minuten bei Raumtemperatur gesammelt und der Überstand entfernt. Resuspendieren Sie die pelletierten Zellen in 500 Mikroliter MB Number One Puffer. Tauen Sie eine Durchstechflasche mit 20 Einheiten pro Mikroliter MNase auf und verdünnen Sie sie mit 10 Millimolar Tris für die im Text beschriebenen Verdauungsbedingungen.
In angemessenen Zeitintervallen von 10 bis 20 Sekunden einen Mikroliter der ersten MNase-Aufschlusslösung in eines der vier Probenröhrchen geben, vortexen und in einem ThermoMixer bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten bei 800 U/min inkubieren. Fügen Sie weiterhin einen Mikroliter aus den verbleibenden MNase-Verdünnungen zu den anderen Zellaliquoten hinzu. Stoppen Sie den MNase-Aufschluss, indem Sie 200 Mikroliter frisch zubereiteten Stopppuffer in die gleiche Reihenfolge und in das gleiche Zeitintervall geben, in dem die MNase zugegeben wurde.
Zwei Stunden bei 65 Grad Celsius inkubieren. Geben Sie 500 Mikroliter PCI zu jeder Probe und mischen Sie sie gründlich durch Vortexing. Bei 19.800 g fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren, um die Phasen zu trennen.
Und übertragen Sie die wässrige Phase auf neue Röhrchen. Reinigen Sie die DNA mit einem handelsüblichen DNA-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers und eluieren Sie die Proben in 12 Mikroliter Elutionspuffer. Geben Sie zwei bis fünf Mikroliter Beladungsfarbstoff in die gereinigte DNA-Probe.
Lassen Sie die Proben auf einem 1,5%igen Agarose-Gel laufen und wählen Sie den besten Aufschlussgrad für das Experiment. Ein optimaler Verdauungsgrad weist wenig bis gar keine subnukleosomalen Fragmente und ein Verhältnis von 70 bis 90 % Mono- zu Dinukleosomen auf. In dieser repräsentativen Stichprobe wurde ein mittlerer Aufschlussgrad zwischen den Bahnen drei und vier für Folgeexperimente ausgewählt.
Basierend auf der MNase-Titration wird das Chromatin verdaut, indem die entsprechende Menge MNase zu jedem Probenaliquot hinzugefügt wird. Gut mischen und im ThermoMixer bei 37 Grad Celsius, 800 U/min 10 Minuten inkubieren. Stoppen Sie den MNase-Aufschluss, indem Sie 1,6 Mikroliter 0,5 molares EGTA zu jedem Aliquot hinzufügen und in einem ThermoMixer bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten mit 800 U/min schütteln.
Die Probe wird durch Zentrifugation bei 10 000 G fünf Minuten lang bei Raumtemperatur entnommen und der Überstand verworfen. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 Mikroliter 1X NEB-Puffer 2.1. Pool-Proben, die einem Input von fünf mal 10 bis zur sechsten Zelle oder weniger entsprechen, zur weiteren Verarbeitung.
Bevor Sie mit der Proximity-Ligatur fortfahren, übertragen Sie 10 % der Probe als Eingangskontrolle, um den MNase-Aufschluss zu überwachen. Geben Sie 150 Mikroliter 10 Millimolar Tris, 25 Mikroliter 10 % SDS und 25 Mikroliter 20 Milligramm pro Milliliter Proteinase K zur Verdauungskontrolle und inkubieren Sie über Nacht bei 65 Grad Celsius. Die verbleibende Probe wird durch Zentrifugieren bei 10.000 g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius gesammelt und der Überstand entsorgt.
Resuspendieren Sie das Pellet in 90 Mikroliter frisch zubereitetem Micro-C-Mastermix und inkubieren Sie es 15 Minuten lang in einem ThermoMixer bei 37 Grad Celsius und 800 U/min. 10 Mikroliter à 5 Einheiten pro Mikroliter Klenow-Fragment zugeben und in einem ThermoMixer inkubieren. Geben Sie dann 100 Mikroliter frisch zubereiteten Micro-C-Mastermix zwei hinzu.
45 Minuten bei 25 Grad Celsius und 800 U/min inkubieren und die enzymatische Reaktion mit EDTA löschen, wie im Text beschrieben. In einem Thermomixer 20 Minuten bei 65 Grad Celsius und 800 U/min inkubieren. Die Probe wird durch Zentrifugation bei 10 000 g fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius entnommen und der Überstand verworfen.
Die Probe wird in 500 Mikroliter frisch zubereitetem Micro-C-Mastermix 3 resuspendiert und 2,5 Stunden lang bei Raumtemperatur bei 15 bis 20 U/min inkubiert. Wiederholen Sie die Zentrifugation und entfernen Sie den Überstand. Anschließend wird die Probe in 200 Mikroliter frisch zubereitetem Micro-C-Mastermix vier resuspendiert und in einem ThermoMixer bei 37 Grad Celsius 15 Minuten lang bei 800 U/min inkubiert.
Für die umgekehrte Vernetzung und Deproteinierung werden 25 Mikroliter 20 Milligramm pro Mikroliter Proteinase K und 25 Mikroliter 10 % SDS zur Probe gegeben und über Nacht bei 65 Grad Celsius mit intermittierendem Mischen inkubiert. Geben Sie 500 Mikroliter PCI zu den Proben und geben Sie die Kontrolle ein und mischen Sie sie dann durch Vortexing. Trennen Sie die Phasen durch Zentrifugation bei 19,800 G für fünf Minuten und überführen Sie die obere wässrige Phase in ein frisches Röhrchen.
Konzentrieren Sie die DNA und eluieren Sie die Proben in 30 Mikrolitern und die Eingangskontrollen in 15 Mikrolitern. Verwenden Sie ein 1,5%iges Agarose-Gel, um die Mononukleosomen und Dinukleosomen zu trennen. Schneiden Sie die DNA-Fragmente heraus, die eine dinukleosomale Größe haben, und extrahieren Sie die DNA, wie im Text beschrieben.
150 Mikroliter vorbereitete Kügelchen zu 150 Mikrolitern der Probe geben und bei Raumtemperatur inkubieren. Legen Sie die Röhrchen in einen geeigneten Magneten und warten Sie, bis sich die Lösung geklärt hat. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Kügelchen in 300 Mikrolitern 1X TBW und wiederholen Sie diesen Schritt.
Wiederholen Sie die magnetische Trennung, und nachdem die Lösung geklärt ist, entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern 0,1X TE. Wiederholen und resuspendieren Sie in 50 Mikrolitern 0,1X TE. Überführen Sie die Lösung in PCR-Röhrchen und führen Sie die DNA-Manipulation wie im Text beschrieben durch. Nachdem die Adapterligation abgeschlossen ist, wird die Probe in 1X TBW gewaschen, der Überstand verworfen und die Kügelchen in 20 Mikrolitern 0,1X TE resuspendiert. Optimieren Sie die Anzahl der PCR-Zyklen und amplifizieren Sie die Sequenzbibliotheken wie im Text beschrieben. Chromatin aus 250.000 Zellen pro Reaktion wurde mit einer vierfachen Verdünnung von MNase verdaut.
Die höchste Konzentration, 10 Einheiten, zeigte überverdautes Chromatin, das fast ausschließlich aus mononukleosomaler DNA bestand. Der Verdau von 250.000 ES-Zellen der Maus mit 0,625 Einheiten MNase bot den vielversprechendsten Ausgangspunkt für präparative Aufschlüsse in Mikro-C-Experimenten. Es sollte jedoch eine mittlere MNase-Konzentration zwischen den in den Spuren drei und vier gezeigten Bedingungen in Betracht gezogen werden, die fünf Einheiten pro 1 Million Zellen entspricht.
Die Proximity-ligierte Mononukleosomenbande hatte eine ungefähre Größe von 300 Basenpaaren, ähnlich der von Dinukleosomen. Daher verschob sich das mono- zu dinukleosomale Bandsignalverhältnis von überwiegend mononukleosomalen hin zu Dinukleosomen. Die Qualität und Quantität der präparierten Sequenzierungsbibliothek wurde mittels Minimal-PCR beurteilt.
Die Visualisierung zeigte eine ausgeprägte Bande bei 420 Basenpaaren und keine Banden für Adapterdimere. Während beide Stichproben in dieser Studie hohe Kartenraten aufwiesen, wies die gute Stichprobe einen höheren Anteil an cis-Reads auf. Eine hohe Rate an transchromosomalen Interaktionen deutet auf zufällige Ligaturereignisse hin, obwohl einige transchromosomale Interaktionen wichtig sein könnten.
Darüber hinaus wies die gute Stichprobe eine moderate Rate an Vorwärts-Rückwärts-Mapping-Lesepaaren auf, mit Entfernungen von weniger als 500 Basenpaaren. Dies deutete auf eine geringe Rate von Dinukleosomen hin, die nicht von MNase gespalten wurden und eine ähnliche Größe wie zwei in der Nähe ligierte Nukleosomen hatten. Ein korrekter MNase-Verdausgrad ist für dieses Experiment von entscheidender Bedeutung.
Überverdaute Nukleosomen werden ineffizient ligiert, und unterverdautes Chromatin weist einen großen Anteil an unverdauten Dinukleosomen auf, die die Sequenzierungsbibliothek kontaminieren können. Micro-C kann mit einem Capture-Ansatz kombiniert werden, um die Locus-spezifische Genomorganisation mit enorm hoher Auflösung zu kartieren.
