Unser Protokoll ist eine in vivo Methode, um die zellautonomen Funktionen von FMRP während der Entwicklung zu untersuchen. Dies kann helfen, die zelltypspezifische Pathophysiologie des Fragile-X-Syndroms zu verstehen. Diese Methode verwendet die stufen-, orts- und richtungsspezifische Elektroporation eines medikamenteninduzierbaren Vektorsystems, das Fmr1-RNA mit kleinen Haarnadeln enthält.
Mit dieser Methode erreichen wir den selektiven FMRP-Knockdown im Hörkreislauf. Diese Methode kann auch angewendet werden, um die Funktion anderer Gene im Hörkreislauf oder im vestibulären System zu untersuchen. Beginnen Sie, indem Sie die Eier horizontal platzieren, um den Embryo zur einfachen Manipulation auf der Oberseite des Eies zu positionieren.
Inkubieren bei 38 Grad Celsius für 46 bis 48 Stunden bis Hamburger und Hamilton, oder HH Stadium 12, für Neuralrohrtransfektion oder für 54 bis 56 Stunden bis HH 13 für Otozystentransfektion. Entfernen Sie die Eier aus dem Inkubator, jeweils ein Dutzend Eier. Eier länger als eine Stunde aus ihrem Inkubator zu halten, führt zu Entwicklungsschwankungen und verringert die Lebensfähigkeit.
Verwenden Sie eine Taschenlampe, um Licht von der Unterseite des Eies zu werfen. Die Lage des Embryos erscheint als dunkler Bereich auf der Eierschale. Markieren Sie die Position des Embryos auf der Eierschale mit einem Bleistift.
Wischen Sie die Eier mit Gaze ab, die 75% Ethanol enthält, und bohren Sie mit der Scherenspitze ein Loch in das spitze Ende der Eier. Entfernen Sie dann zwei Milliliter Albumin mit einer 18-Gauge-Nadelspritze. Stellen Sie sicher, dass das Loch nur groß genug ist, um das Einführen der Nadel zu ermöglichen.
Wischen Sie auslaufendes Albumin mit Gaze ab und verschließen Sie das Loch mit durchsichtigem Klebeband. Bedecken Sie die Oberseite der Eier mit durchsichtigem Klebeband und zentrieren Sie sich auf den bleistiftmarkierten dunklen Bereich, um Risse zu minimieren und herabfallende Schalenablagerungen während des Fensters zu verhindern. Wischen Sie alle chirurgischen Werkzeuge mit Gaze ab, die 75% Ethanol enthält, und wischen Sie den mit Klebeband bedeckten Bereich mit 75% Ethanol ab.
Verwenden Sie eine kleine Schere, um ein bis zwei Quadratzentimeter großes Fenster um den Umfang der Bleistiftmarkierung zu schneiden. Halten Sie die Schere flach, um den darunter liegenden Embryo nicht zu beschädigen. Legen Sie das Fensterei unter ein Stereomikroskop mit einem 10-fachen Okular und einem 2-fachen Zoom.
Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit der Tintenlösung und passen Sie dann eine 27-Gauge-Nadel an. Biegen Sie die Nadel mit einer Pinzette in einen Winkel von 45 Grad. Unter dem Mikroskop vorsichtig vom Rand des Opaqua-Bereichs stechen und die Nadel unter den Embryo einführen.
Injizieren Sie etwa 50 Mikroliter Tinte, die unterhalb des Bereichs pellucida diffundiert, um den Embryo sichtbar zu machen. Die Tinte bildet einen dunklen Hintergrund für die klare Visualisierung des Embryos. Glaskapillaren mit einem Pipettenzieher in Pipetten ziehen.
Öffnen Sie unter einem Seziermikroskop vorsichtig die Spitze der Kapillarnadel mit einer Pinzette auf 10 bis 20 Mikrometer Durchmesser. Bewahren Sie die Pipetten bis zur Verwendung in einer Aufbewahrungsbox auf. Als nächstes füllen Sie eine Kapillarpipette mit 0,5 bis 1 Mikroliter der Plasmidmischung, indem Sie Unterdruck durch einen Gummischlauch am Ende der Pipette mit einer Spritze anlegen.
Legen Sie das Ei unter das Mikroskop, so dass der Embryo vertikal ausgerichtet ist und der Schwanz in Ihrer Nähe ist. Halten Sie die Kapillarpipette mit einer Hand oder mit dem dreiachsigen Manipulator und fahren Sie die Spitze der Pipette zur Raute 5 bis 6. in Tail-to-Head-Richtung.
Stecken Sie die Spitze vorsichtig durch die Vitellamembran und in das dorsale Neuralrohr und ziehen Sie dann die Pipette ein wenig zurück, so dass sich die Spitze im Lumen des Neuralrohrs befindet. Das Plasmidgemisch wird durch Anlegen von Luftdruck injiziert, bis das getönte Plasmid vollständig in Rhombomer 5 bis 6 diffundiert und sich in Rhombomer 3 und Rhombomer 4 erstreckt. Überprüfen Sie die erfolgreiche Injektion, die erreicht wird, wenn die blaue Plasmidlösung schnell durch das Neuralrohr diffundiert, ohne zu lecken.
Wenn es zu Undichtigkeiten kommt, verblasst das Blau schnell. Unmittelbar nach der Injektion platzieren Sie eine Platin-Bipolarelektrode auf beiden Seiten des Neuralrohrs. Liefern Sie zwei Impulse von 12 Volt und 50 Millisekunden Dauer mit einem Elektroporator.
Beobachten Sie Luftblasen an den Enden der bipolaren Elektrode, mit mehr auf der negativen Seite. Überprüfen Sie die erfolgreiche Elektroporation, die erreicht wird, wenn die getönte Plasmidmischung in das Neuralrohrgewebe in der Nähe der positiven Seite der Elektrode gelangt. Entfernen Sie nach der Elektroporation vorsichtig die bipolare Elektrode.
Decken Sie das Fenster auf der Eierschale mit einem Stück transparenter Folie ab, die auf zwei Zoll große Quadrate vorgeschnitten und mit 75% Ethanol besprüht wurde. Legen Sie das Ei zurück in den Inkubator. Reinigen Sie die bipolare Elektrode, indem Sie 10 bis 20 Impulse mit 12 Volt und einer Dauer von 50 Millisekunden in Kochsalzlösung abgeben, bevor Sie zum nächsten Ei übergehen.
Legen Sie das Ei unter dem Mikroskop so, dass der Embryo vertikal mit dem Schwanz in Ihrer Nähe ist. Halten Sie die Kapillarpipette und stoßen Sie die rechte Otozyste vorsichtig in dorsolaterale Richtung. Injizieren Sie die Plasmidmischung mit Luftdruck, bis die Otozyste mit blauer Lösung gefüllt ist.
Überprüfen Sie eine erfolgreiche Injektion, die erreicht wird, wenn die blaue Plasmidmischung in der Otozyste eingeschlossen ist und nicht austritt. Setzen Sie unmittelbar nach der Injektion die bipolare Elektrode auf die Otozyste und positionieren Sie die positive und negative Seite vor bzw. hinter der Otozyste. Liefern Sie zwei Impulse von 12 Volt und 50 Millisekunden Dauer mit dem Elektroporator.
Überprüfen Sie die erfolgreiche Elektroporation, die erreicht wird, wenn die blaue Plasmidmischung in das Gewebe der Otozyste in der Nähe der positiven Seite der Elektrode eindringt. Entfernen Sie nach der Elektroporation vorsichtig die bipolare Elektrode und bedecken Sie das Fenster auf der Eierschale mit einer transparenten Folie. Zum Schluss bringen Sie das Ei in den Inkubator zurück.
Das repräsentative Bild zeigt ein Beispiel für den embryonalen dritten Tag oder E3 nach Neurotubentransfektion und Doxbehandlung am zweiten embryonalen Tag oder E2. Transfizierte Zellen mit Fmr1 shRNA und EGFP im Querschnitt sind hier dargestellt. EGFP-exprimierende Zellen waren auf eine Seite des Neuralrohrs und des Hirnstamms beschränkt. Ein Querschnitt bei E15 mit EGFP-exprimierenden Nucleus magnocellularis, oder NM-Neuronen, auf der transfizierten Seite ist hier gezeigt.
Auf der kontralateralen Seite wurden EGFP-haltige Axone im ventralen Teil des Nucleus laminaris oder NL beobachtet. Der Knockdown-Effekt der Fmr1-shRNA wurde durch eine deutliche Verringerung der FMRP-Immunreaktivität in transfizierten NM-Neuronen im Vergleich zu benachbarten nicht transfizierten Neuronen validiert. Das Gehörganglion an E19 mit FMRP-Immunreaktivität ist hier dargestellt. Auditorische Ganglienneuronen wurden nicht transfiziert.
Einige Gliazellen, die von den kranialen Neuralleistenzellen abgeleitet wurden, wurden transfiziert. Die repräsentativen Bilder zeigen FMRP-Knock-down im Gehörgang nach Otozystentransfektion. Gehörgänge an E9 wiesen eine umfangreiche EGFP-Fluoreszenz auf.
Auf Querschnitten befanden sich EGFP-exprimierende Zellen in der Basilarpapille und dem Gehörganglion. Der Knockdown-Effekt von Fmr1 shRNA wurde durch reduzierte FMRP-Immunreaktivität in transfizierten Haarzellen im Vergleich zu benachbarten nicht transfizierten Haarzellen validiert. In ähnlicher Weise war die FMRP-Immunreaktivität in transfizierten auditorischen Ganglienneuronen weitgehend verringert.
Die zentrale Projektion der transfizierten auditorischen Ganglienneuronen wurde über den Hörnerv mit charakterisierten Endbulb-Terminals zum Hirnstamm verfolgt. Bei diesem Verfahren ist es am wichtigsten, den Ort und die Richtung der Elektroporation für die selektive Transfektion zu kontrollieren. Nach diesem Verfahren kann Einzelzellfüllung, Immunfärbung, Zellsortierung gefolgt von Massenspektrum oder Einzelzellsequenzierung durchgeführt werden, um die Veränderungen auf morphologischer und biochemischer Ebene aufzudecken.
Diese Technik ermöglicht auch die selektive Bearbeitung anderer Gene mit zeitlicher Kontrolle und Komponentenspezifität im Hörohr für Stammschaltkreise und kann modifiziert werden, um das vestibuläre System zu manipulieren.
