Das Protokoll bietet eine genaue, sichere und effiziente nicht-chirurgische Alternative zu herkömmlichen chirurgischen und blinden Injektionsmethoden. Es ist auch die genaueste Injektionstechnik für Atrophie-Thymusen bei gealterten oder immundefizienten Mäusen. Der entscheidende Vorteil ist ein minimal belastendes Injektionsverfahren, das sehr sicher und präzise, aber auch schnell ist und so groß angelegte Experimente ohne Datenkompromittierung durch chirurgische stressbedingte Immunsuppression ermöglicht.
Die Ausrichtung von Nadel und Schallkopf beizubehalten, während sie durch die Brustwand geschoben werden, erfordert etwas Übung. Wir empfehlen daher, mit einem erfahrenen interventionellen Radiologen zusammenzuarbeiten, um Injektionen durchzuführen oder Schulungen durchzuführen. Shaina Anuncio, eine Technikerin aus meinem Labor, hilft bei der Demonstration des Verfahrens.
Tragen Sie zunächst eine dünne Schicht Enthaarungscreme für weniger als eine Minute auf den vorderen Brustbereich der Mäuse auf, um das Fell zu entfernen. Verwenden Sie ein nasses Papiertuch, um die Creme und das lose Fell zu entfernen. Bestätigen Sie die entsprechende Anästhesietiefe, indem Sie nicht auf die Hinterpfote reagieren.
Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern. Platzieren Sie jeweils eine Maus in Rückenlage auf der beheizten Plattform der Ultraschall-Bildgebungsstation für Kleintiere mit dem Nasenkegel. Befestigen Sie die Maus mit medizinischem Klebeband an den Hinter- und Vorderbeinen auf der Bühne.
Desinfizieren Sie die fellfreie obere Thoraxhaut mit einem Chlorhexidingluconat-Applikator. Aktivieren Sie die höchste verfügbare Frequenz-Linearsonde. Typischerweise die Sonde mit der höchsten räumlichen Auflösung für die Größe des abgebildeten Tieres.
Aktivieren Sie die Sonde, indem Sie nach dem Startbildschirm auf die entsprechende Schaltfläche tippen. Um die Ultraschalleinstellungen für Bildgebung und Injektion zu optimieren, stellen Sie die Tiefe des Sichtfeldes auf eine für das Zieltier geeignete Größe ein, indem Sie die vertikal ausgerichteten Schieberegler auf der rechten Seite des Bildschirms anpassen. Passen Sie die Graustufenverstärkung an, indem Sie die Schaltfläche entlang des horizontalen Balkens am unteren Bildschirmrand schieben.
Stellen Sie dann die Fokuszone auf das erwartete Niveau des Thymus ein. Tragen Sie etwa einen Milliliter Ultraschallgel aufrecht auf die Oberfläche des Schallkopfes auf, entweder im Halter des Ultraschallgeräts oder in den Händen eines Assistenten. Um ein kleines steriles Feld neben der beheizten Plattform vorzubereiten, leeren Sie eine sterile Sondenabdeckung, Gummiband, sterile Handschuhe und steriles Ultraschallgel auf das sterile Feld.
Dann ziehen Sie die sterilen Handschuhe an. Legen Sie die sterile Sondenabdeckung vorsichtig über den Ultraschallwandler und das Gel. Um die Sterilität zu erhalten, berühren Sie nur die sterile Abdeckung.
Schieben Sie das sterile Gummiband über die Sondenabdeckung, um es an Ort und Stelle zu halten. Geben Sie zwei bis drei Milliliter steriles Ultraschallgel auf den Schallkopf. Platzieren Sie die Ultraschall-Gelsonde vertikal auf dem desinfizierten Teil der vorderen Brustwand der Maus für die erste Bildgebung, während die Sterilität erhalten bleibt.
Betrachten und optimieren Sie das Ultraschallbild, wie zuvor gezeigt. Um die vordere Brust der Maus in einer Querebene zu scannen, halten Sie den Schallkopf vertikal und bewegen Sie ihn in einer pinselartigen oder schwungvollen Bewegung vom Hals zum Bauch auf und ab. Wenn das Herz im Sichtfeld zentriert ist, streichen Sie den Schallkopf leicht in Richtung Hals.
Beachten Sie die beiden runden gepaarten schwarzen Strukturen auf beiden Seiten der oberen Brust. Lokalisieren Sie mit der Ultraschallsonde den breitesten Teil des Thymus, der normalerweise die ideale Zielstelle für die Injektion ist. Erwarten Sie eine horizontale Nadelbahn an der gewählten Stelle und notieren Sie, wo sich die wichtigsten Blutgefäße an dieser Stelle befinden.
Diese Gefäße sollten während der Injektion vermieden werden. Die Blutgefäße werden echoarme pulsatile Strukturen sein. Wenn Sie sich nicht sicher sind, aktivieren Sie den Farbdoppler-Modus, indem Sie auf die Farbtaste auf dem Bildschirm tippen, um den Fluss innerhalb der Gefäße zu überprüfen.
Halten Sie den Schallkopf in der einen Hand und eine 30-Gauge-Insulinnadel mit 10 Mikrolitern Injektion in der anderen. Um den Injektionsvorgang zu beginnen, bewegen Sie den Schallkopf seitlich, so dass der Thymus im Ultraschallsichtfeld nicht mittig ist. Stellen Sie sicher, dass die andere Seite des Sichtfeldes hauptsächlich aus Ultraschallgel besteht und sonst nichts.
Legen Sie die Nadelspitze in das Gel unter dem Schallkopf und bewegen Sie die Nadel langsam, bis sie neben der Hautoberfläche sichtbar ist. Während Sie die Nadel kontinuierlich unter Ultraschall abbilden, führen Sie die Nadel mit einer perkutanen Flugbahn weg von den Blutgefäßen in die Thymusdrüse ein. Verwenden Sie eine horizontale Flugbahn des Kreuzthymus, um die Nadelspitze im Thymuslappen kontralateral zur Eintrittsstelle zu platzieren.
Sobald sich die Nadelspitze im gewünschten Teil des Thymus befindet, injizieren Sie schnell den Inhalt aus der 30-Gauge-Spritze, während Sie die sonographische Visualisierung verwenden. Um die Spritze während des Nadeleinführens und der Injektion zu stabilisieren, halten Sie die Spritze zwischen Daumen und dritten Finger und steuern Sie den Spritzenkolben mit dem Zeigefinger. Entfernen Sie die Nadel, nachdem der gesamte Inhalt abgelegt wurde.
Bei jungen Mäusen war die Identifizierung der Thymusdrüse aufgrund der Größe der Drüse einfach. Es war schwieriger bei älteren oder immundefizienten Mäusen. Mit modernen Ultraschallgeräten war es jedoch immer noch sehr gut machbar.
Eine erfolgreiche Injektion wurde festgestellt, wenn die Nadel kritische Strukturen wie das Herz, die Aorta oder eine der unteren Hohlvene nicht durchquerte. Die Nadelspitze wurde während der Injektion an ihrer Zielstelle sichtbar gemacht und bestätigte die intrathymische Ablagerung. Die intrathymische Lokalisation der Injektion wurde unter Verwendung von Luciferin als Injektion in transgene Luciferase-Mäuse bestätigt.
Diese wurden sofort mit Biolumineszenz-Bildgebung ausgewertet, um die korrekte Position der Injektion zu bestätigen, ohne das Tier zu opfern. Alternativ wurde Trypanblau als visueller Marker der Injektionsstelle und der Injektionsgenauigkeit unter Verwendung von ex vivo mit Nekropsie injiziert. Unsere Gruppe hat diese Technik für mehrere große Studien verwendet, einschließlich der Krebsimmuntherapieforschung, basierend auf der Injektion genetisch veränderter Vorläuferzellen, und zur Verbesserung der Thymusfunktion bei immundefizienten Mäusen.
