Das hier demonstrierte Protokoll ermöglicht die Markierung und Isolierung spezifischer Zelllinien, die in Ovarialfollikeln vorhanden sind, beginnend in frühen Antralstadien, wodurch die hochauflösende Analyse und Kultur ermöglicht wird. Dieser hochpräzise Ansatz nutzt Kombinationen von Fluorophor-konjugierten Antikörpern, um Zelloberflächenmarker zu erreichen, die robust und spezifisch in diskreten Granulosa-, Stroma- und Theka-Linien exprimiert werden. Legen Sie zunächst den Eierstock in eine sterile Petrischale und gießen Sie ein gekühltes Medium dazu, um das Gewebe mit Feuchtigkeit zu versorgen, wobei Sie sicherstellen, dass der Eierstock halb in das Medium eingetaucht ist.
Entfernen Sie alle Nähte oder anderes Material und präparieren Sie das restliche umgebende Gewebe vom Eierstock weg. Um die Antralfollikel zu isolieren, identifizieren Sie einzelne Follikel und wählen Sie gesunde Follikel aus. Schließen Sie blutgefüllte, dunkle oder unsymmetrische Follikel aus.
Isolieren Sie die ausgewählten Antralfollikel mit Skalpellen aus dem Eierstock, wobei das Antrum intakt bleibt und das kortikale Gewebe, das den Follikel umfasst, herausgeschnitten wird. Platzieren Sie jeden herausgeschnittenen intakten Antralfollikel in einer Vertiefung der Sechs-Well-Platte. Bestimmen Sie mit einem Lineal, das unter der Schale platziert wird, den Follikeldurchmesser zu beschreibenden Zwecken.
Halbieren Sie mit einem Skalpell den intakten Antralfollikel, um die Antralhöhle zu beurteilen, und fügen Sie sechs Milliliter enzymatisches Zellablösungsmedium hinzu, bevor Sie die Platte 10 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator inkubieren. Nach der Inkubation werden sechs Milliliter des verfügbaren Mediums mit 20 % fötalem Kälberserum (FBS) hinzugefügt und durch wiederholtes kräftiges Pipettieren über die halbierten Follikel mit einer P-1000-Mikropipette mit dem Medium gespült. Als nächstes wird das Medium aufgefangen und durch einen 100-Millimeter-Filter geleitet.
Nachdem Sie den filtrierten Überstand drei Minuten lang bei 300 G und vier Grad Celsius zentrifugiert haben, saugen Sie den Überstand ab. Geben Sie das verbleibende Gewebe vor 30 Minuten Inkubationszeit in eine Mischung aus 100 Einheiten pro Milliliter Kollagenase und einer Einheit pro Milliliter, die in einer ausgewogenen Kochsalzlösung verdünnt wird. Mechanisches Aufbrechen des Gewebes durch Verreiben und kräftiges Pipettieren zweimal nach 10 und 20 Minuten.
Wenn Sie fertig sind, gewinnen Sie das Gewebe und spülen Sie es durch Pipettieren, durch eine P-1000-Mikropipettenspitze und seihen Sie es durch einen 100-Milliliter-Filter. Zentrifugieren Sie das belastete Gewebe bei 300 G und vier Grad Celsius für drei Minuten, bevor Sie das mit den Thekazellen und Stromazellen angereicherte Zellpellet zur Markierung und FACS auf Eis legen. Um Granulosazellen und Thekazellen zu identifizieren, resuspendieren Sie die Zellpellets in einer Blockierungslösung mit direkt konjugierten Antikörpern und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius.
Nach dem Waschen und Zentrifugieren der Zellen resuspendieren Sie die Zellen in FACS-Puffer, der 4-6 Diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthält, und lassen Sie die Zellsuspension durch ein FACS-Instrument laufen, um eine kleine Population der Zellen zu erfassen, wobei die Fluoreszenzintensität von Fluorophor-konjugierten Antikörpern für das Gating verwendet wird. Den Rest des Eierstocks halbieren. Entfernen Sie das Mark mit einer gebogenen feinen Schere und einem Skalpell, um eine Schädigung der Eierstockrinde zu vermeiden.
Setzen Sie die Verarbeitung und Ausdünnung der Eierstockrinde durch sanftes Schaben fort, bis ein minimales Mark übrig bleibt. Teilen Sie das kortikale Gewebe in zwei bis drei Millimeter breite Streifen entlang der Eierstocklänge. Zum Einfrieren von Eierstockgewebe legen Sie einen kortikalen Streifen in jede gekühlte kryogene Durchstechflasche, die die Gefrierlösung enthält.
Schütteln Sie die kryogenen Fläschchen mit den kortikalen Streifen auf einer rotierenden Platte 20 Minuten lang bei vier Grad Celsius. Initiieren Sie die Bildung von Eiskristallen, indem Sie jedes Kryofläschchen mit einer Wattestäbchen berühren, die kurz in flüssigen Stickstoff getaucht ist. Die Ovarialzellen wurden entnommen und die Zellfraktionen aus den Antralfollikeln FACS auf einen Reinheitsgrad von mehr als 95% sortiert.
CD99-spezifisch markierte Granulosazellen in PVRL1 oder Nektin wurden mit zunehmender Größe der Antralfollikel zunehmend im Zellkompartiment von Oophorus granulosa lokalisiert. Es zeigte sich, dass die Antikörper gegen Endoglin oder CD55 spezifisch alle Stroma- und Thekazellen abgrenzten und dass Alaninaminopeptidase spezifisch von androgenen Thekazellen exprimiert wurde. Die Zellen wurden mit einem Antikörper gegen CD99 markiert, um Granulosazellen zu identifizieren, und Antikörper gegen CD45 wurden verwendet, um hämatopoetische Zellen auszuschließen.
Antikörper gegen PVRL1 trennten die Granulosazellpopulation in Oophorus- und Wandkompartimente. Nach enzymatischer Verdauung mit Kollagenase-Dispase ermöglichten die mit Antikörpern gegen CD55, CD34 und Alanin-Aminopeptidase markierten Zellpräparate die Erfassung aller Stroma- oder Thekazellen oder androgenen Thekazellen unter Ausschluss der Endothelzellen aus den Populationen der Thekazellen. Achten Sie besonders darauf, dass das Antrum der Follikel während der anfänglichen Follikelisolierung nicht unterbrochen wird, indem Sie innerhalb eines sicheren Randes um die Follikelränder schneiden.
Nach diesem Verfahren können die Zellen für molekulare oder diagnostische Analysen verwendet oder alternativ in vitro für toxikologische Studien, experimentelle Analysen oder die Rekapitulation der Follikelmikroumgebung kultiviert werden. Bisher wurden diese Methoden verwendet, um endokrine Erkrankungen des Eierstocks zu modellieren und neue Subpopulationen follikelassoziierter Zellen zu identifizieren.
