単一細胞または細胞タイプのトランスクリプトーム解析は、不均一性によってマスクされる遺伝子発現の微妙な違いを検出することができ、これは精巧な細胞内制御メカニズムを明らかにするための強力なツールです。蛍光活性化セルソーティングとそれに続くRN-seq解析は、高い転写物検出感度と他のマルチオミクスアプローチとの互換性を備えたシングルセルまたはバルクセルタイプモードで実行できます。このプロトコルを初めて使用する場合は、プロトプラストのソーティングとRNA-seqライブラリの準備のいくつかのステップに注意を払う必要があります。
Jun Zhangとともに、私たちの研究室のポスドクであるRongrong Xie博士が手順のデモンストレーションを支援します。まず、シロイヌナズナ野生型と蛍光マーカーラインの種子を20%漂白剤に入れ、回転インキュベーターを使用して室温で15分間インキュベートし、種子を殺菌します。滅菌ベンチで作業しながら、種子を二重蒸留水で3〜5回すすいでください。
野生型とレポーターラインの種子を、体積あたり0.8%の重寒天培地で半強度のMS培地にプレートします。摂氏4度で2日間植物を層別化する。次に、16時間の光と18時間の暗のサイクルの下で、摂氏23度で5日間垂直に育てます。
実験の前に、溶液Aおよび溶液Bと呼ばれるプロトプラスト溶液を氷上で穏やかに解凍します。きれいな刃またははさみを使って植物から根を切り取り、根を約0.5センチメートルに切り刻みます。刻んだ根を1.5ミリリットルの溶液Bに浸し、続いて室温で1.5〜2時間穏やかに回転させる。
得られた根のプロトプラストを40ミクロンのストレーナーメッシュでろ過し、メッシュを1〜2ミリリットルの溶液ですすぎます A.合わせたろ液を300 Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。ピペットを使用して上清を捨て、細胞ペレットを500〜600マイクロリットルの溶液Aに再懸濁し、直ちに氷上に置きます。細胞選別のために、再懸濁した細胞溶液を新しい5ミリリットルの試験管に移します。
シース液タンクを満たし、廃棄物タンクを確認します。次に、蛍光活性化セルソーティングまたはFACSマシンの電源を入れます。ソーターで機器のセットアップと自動キャリブレーションの手順を実行します。
蛍光チャンネルを選択し、蛍光のない野生型植物をベースラインコントロールとして使用します。蛍光強度と前方散乱および側方散乱シングレットに基づいてソーティングゲートを調整します。500マイクロリットルの溶液Aを1.5ミリリットルの収集チューブに加えた後、選別を開始し、チューブあたり2, 000〜3, 000セルを収集します。
選別後、すぐにサンプルを氷の上に置きます。細胞を含む回収チューブを300G、摂氏4度で5分間遠心分離し、ピペットで上清を除去します。2マイクロリットルの選別された細胞を取り、蛍光顕微鏡を使用して蛍光を確認します。
ソートされたセルをすぐに使用しない場合は、摂氏マイナス80度で保管します。シングルセルインデックスソーティングの場合は、メンブレン付きの96ウェルプレートをアダプターに入れます。液滴がプレートの中央の穴に落ちるようにプレートの位置を調整します。
96 ウェル・プレートからメンブレンを取り外し、96 ウェル・プレートをアダプターに入れます。並べ替え時に単一セルの並べ替えモードを選択します。ソートされたセルの目標数を1つとして入力し、ソートを開始します。
実験を開始する前に、表面の除染剤と75%エタノールでベンチを清掃してください。すべての機器は、シーケンシングライブラリの準備にのみ使用してください。選別したサンプルに1マイクロリットルの新たに調製した混合物Aを加えた後、滅菌乳棒で粉砕する。
RNAseフリー水を使用して、容量を14マイクロリットルに構成します。次に、各サンプルを0.2ミリリットルの薄肉PCRチューブに移します。次に、混合物Bを準備し、サンプルを含む各PCRチューブに混合物Bの4.4マイクロリットルを追加し、穏やかなピペッティングで混合します。
サンプルを摂氏72度で3分間インキュベートします。インキュベーション後、直ちにサンプルを氷上に置いて、オリゴdTをポリAテールにハイブリダイズさせる。逆転写反応混合物または混合物Cを21.6マイクロリットルで調製し、サンプルを含む各チューブに。
逆転写プログラムに従って、一般的なPCR機器でサンプルを逆転写反応にかけます。新たに調製したプレアンプ反応混合物または混合物Dを逆転写反応産物に40.8マイクロリットル加え、プレアンププログラムを実行します。増幅サイクルは、反応が指数関数的段階に入ったばかりのときの定量的PCRによって決定できます。
プレアンプ反応産物を精製するには、プリアンプ産物をPCRチューブから1.5ミリリットルチューブに移します。48マイクロリットルのAMPure XPビーズを各サンプルに加え、インキュベーション前にピペッティングで穏やかに混合します。サンプルとビーズを入れた1.5ミリリットルのチューブを磁気分離スタンドに5分間置きます。
ビーズを乱すことなく、サンプルから上清を慎重に廃棄します。それらを200マイクロリットルの80%エタノールに再懸濁した後、さらに3分間磁気分離スタンドに置きます。エタノール含有上清を捨てた後、サンプルをチューブ中で10分間風乾する。
ビーズを20マイクロリットルのヌクレアーゼ遊離水に再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。次に、それらを磁気分離スタンドに5分間置きます。ピペットを使用して、各チューブから18マイクロリットルの上清を新しい1.5ミリリットルの遠沈管に移します。
最後に、本文に記載されている手順に従ってプレライブラリの特性評価を行い、ライブラリの構築、精製、定量を行います。蛍光性シロイヌナズナマーカー株は、蛍光タンパク質と標的細胞型に特異的に発現する遺伝子を融合させること、またはエンハンサートラップ株を用いて開発されました。蛍光特異的にマーキングされたプロトプラストは、蛍光強度と前方散乱および側方散乱一重項に基づいて正常にソートされました。
選別された細胞を明視野および蛍光イメージングを用いて可視化した。約2,000個の木部極周回細胞、側根始原細胞、内皮または皮質細胞、および側根冠細胞のRNAシーケンシングライブラリの代表的な結果が示されている。プライマーまたはアダプターの二量体ピークを含む小さなサイズのライブラリでも、サイズ選択後に配列決定することができます。
異常なサイズ分布を持つライブラリーは、ライブラリーの準備に失敗したことを示しています。遺伝子発現パターンを解析した。4つの根細胞タイプのいずれかで濃縮された遺伝子をクラスター化し、異なる細胞タイプ間の遺伝子発現の特異性を示すヒートマップに示しました。
正しいゲーティングとソーティング、RNA分解の防止による標的細胞の高品質と純度は、ライブラリ構築を成功させるための鍵です。シングルセルモードのRNA-seqについては、ユニークな分子識別子と統合されたいくつかの方法が最近報告されており、パフォーマンスが大幅に向上しています。
