Der Notch-Signalweg steuert die Sulfatentscheidung und die Musterbildung während der Entwicklung in Metazoen. Wir haben einen Antikörper-Aufnahme-Assay entwickelt, um den Notch-Liganden delta-D zu markieren und seinen endozytären Transport in radialen Gliavorläuferzellen im sich entwickelnden Vorderhirn von Zebrafischen abzubilden. Die ventrikuläre Injektion des versteckten Gehirns des Zebrafisches ermöglicht die selektive Aufnahme von Anti-Dld-Atto-647N durch myototische radiale Gliavorläuferzellen, die die in der Entwicklung befindlichen Hirnventrikel auskleiden, mit hoher Effizienz und lang anhaltender Wirkung.
Dieses Protokoll kann leicht mit anderen pharmakologischen oder genetischen Störungen kombiniert werden, die in verschiedenen Entwicklungsstadien verwendet werden und möglicherweise an das erwachsene Gehirn sowie an aus menschlichen pluripotenten Stammzellen gewonnene 2D- oder 3D-Gehirnorganoide angepasst werden. Nachdem Sie die befruchteten Embryonen erzeugt und 18 bis 20 Stunden lang inkubiert haben, nehmen Sie sie aus dem Inkubator. Betrachten Sie sie unter einem Epifluoreszenzmikroskop mit weißem Licht zunächst bei 20-facher Vergrößerung.
Entsorgen Sie tote Embryonen, die unter dem Mikroskop trüb oder geplatzt erscheinen, mit einer Glaspipette. Schalten Sie dann die Leuchtstofflampe ein und wählen Sie die RFP-Filtereinstellung des Mikroskops. Wählen Sie die Embryonen mit starker roter Fluoreszenz aus und geben Sie sie in eine neue Schale mit Eiwasser.
Nun entchorionisieren Sie die Embryonen manuell mit zwei feinen Pinzetten unter weißem Licht. Halten Sie das Chorion mit einer Pinzette fest und machen Sie mit der anderen Pinzette einen Riss in das Chorion. Öffnen Sie den Riss vorsichtig mit der Pinzette und machen Sie ihn groß genug, damit der Embryo hindurchgehen kann, indem Sie den Embryo vorsichtig mit den Spitzen der anderen Pinzette drücken.
Übertragen Sie die dechorionierten Embryonen in eine neue Petrischale mit frischem embryonalem Medium, um sie vor der Mikroinjektion schnell zu spülen. Nachdem Sie feine Injektionsnadeln an einem Abzieher gezogen haben, öffnen Sie die Nadelspitze mit einer Pinzette unter einem Stereodissektionsmikroskop. Machen Sie den Durchmesser der Spitze auf etwa 10 Mikrometer und den Verjüngungswinkel auf etwa 30 Grad.
Mischen Sie nun 0,5 Mikroliter des Anti-Dld-Antikörpers mit zwei Mikrolitern des Anti-Maus-Antikörpers L G Atto-647N durch fünfmaliges Pipettieren, um sie zu konjugieren, und inkubieren Sie sie mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation fügen Sie der Antikörpermischung 2,5 Mikroliter Blockierungspuffer und 0,5 Mikroliter 0,5%Phenolrot hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren, um alle in der Mischung verbleibenden unkonjugierten Antikörper zu blockieren. Als nächstes bereiten Sie 1%Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt im Embryomedium vor.
Erhitzen Sie die Agarose-haltige Mischung bei 70 Grad Celsius, bis die Mischung durchsichtig wird. Nachdem Sie die Agaroselösung aliquotiert haben, bewahren Sie sie in einem Wärmeblock bei 40 Grad Celsius auf. Spülen Sie den Embryo drei Sekunden lang in dem Röhrchen aus, das 1% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt enthält.
Legen Sie den Embryo auf einen umgekehrten Petrischaledeckel aus Kunststoff mit einzelnen Agarosetropfen, um jeden Embryo separat zu montieren. Legen Sie die Embryonen flach seitlich in die Agarose und halten Sie diese Position, bis die Agarose bei Raumtemperatur erstarrt ist. Bedecken Sie alle montierten Embryonen in der Agarose mit Eimedium.
Legen Sie die eingebetteten Embryonen unter das Stereomikroskop und bedecken Sie die Agarose mit Eiwasser. Stellen Sie den Luftdruckinjektor mit Mikromanipulatoren ein und platzieren Sie sie in der Nähe der Mikroskope. Verwenden Sie die Stahlgasflasche, die gasförmigen Stickstoff unter hohem Druck enthält, als Luftressource.
Sobald die Embryonen in die Agarose eingesetzt wurden, öffnen Sie das Gasventil. Während Sie das Frontfill-Modul des Mikroinjektors verwenden, laden Sie die vorbereitete Glasnadel mit zwei Mikrolitern Antikörpermischung auf den Mikromanipulator. Stellen Sie nun den Eingangsdruck auf 80 bis 90 Pfund pro Quadratzoll und den Einspritzdruck auf 20 Pfund pro Quadratzoll ein.
Kalibrieren Sie das Injektionsvolumen mit einem Mikrometer unter dem Mikroskop. Stellen Sie die Dauer der Abstimmungszeit entsprechend der Größe der Nadelöffnung von 10 bis 120 Millisekunden ein. Tippen Sie auf das Paddel, um jeden Injektionsimpuls abzugeben, und stellen Sie das Injektionsvolumen jeder Injektion auf vier bis fünf Nanoliter ein.
Stechen Sie dann die Spitze der Mikroinjektionsnadel durch die dorsale Dachplatte des Hinterhirns, hinter dem Rondimer-Null-Eins-Scharnierpunkt, und injizieren Sie etwa 10 Nanoliter Antikörpermischung, ohne das Hirngewebe zu treffen. Beobachtete den Fluss roter Flüssigkeiten in der Hirnkammer. Entfernen Sie nach der Injektion die Nadelspitze schnell vom Embryo, indem Sie den Knopf des Mikromanipulators drehen.
Für eine erfolgreiche Injektion verbleibt der rote Farbstoff der injizierten Mischung stabil in der Hirnkammer, ohne in die umgebende Agarose auszutreten. Bewegen Sie die Montageplatte unter das Mikroskop, um einen anderen montierten Embryo an einer geeigneten Position für Wiederholungen zu lokalisieren. Nachdem Sie sechs bis acht Embryonen injiziert haben, schälen Sie die Agarose mit einem mikrochirurgischen Messer, um die Embryonen aus der eingebetteten Agarose zu lösen.
Übertragen Sie die mikroinjizierten Embryonen in eine frische Schale mit 30 Millilitern Embryomedium und legen Sie sie für die nächsten Schritte auf Raumtemperatur. Nach 30 Minuten werden die ausgewählten Embryonen in 10 Milliliter Embryomedium übertragen. Um die Embryonen zu montieren, bereiten Sie Agarose mit 0,8 % niedrigem Schmelzpunkt vor, die die gleiche Konzentration an Trican im Röhrchen enthält.
Tauchen Sie die injizierten Embryonen mit einer Glaspipette drei Sekunden lang in die warme Agarose. Dann werden die Embryonen sofort mit der gleichen Glaspipette aus der Agarose entnommen und die Embryonen mit einem Tropfen Agarose aus dem Röhrchen in die Mitte von 35-Millimeter-Glasbodenkulturschalen gelegt. Richten Sie die Embryonen vorsichtig mit einer Fasersonde oder einer Belastungsspitze aus, um die dorsale Seite des embryonalen Gehirns so nah wie möglich am Glasboden zu halten.
Drehen Sie die Position des Embryos vorsichtig, um den Embryo zu dehnen, ohne sich zu kräuseln, während sich die Agarose allmählich verfestigt. Überprüfen Sie anschließend die Position des Embryos, indem Sie die Glasbodenschale umdrehen. Stellen Sie sicher, dass das gesamte dorsale Vorderhirn mit den korrekt montierten Embryonen unter dem Mikroskop zu sehen ist.
Fügen Sie zwei bis drei Milliliter 28,5 Grad Celsius warmes embryonales Medium hinzu, das Trican enthält, um den Embryo zu bedecken. Stellen Sie die Schüssel richtig auf den temperaturgesteuerten Tisch des konfokalen Mikroskops und stellen Sie die Temperatur der Bildgebungskammer auf 28,5 Grad Celsius ein. Der Embryo ist nun bereit für die Bildgebung.
Die injizierten Atto-647N-Embryonen zeigten eine Hintergrundfluoreszenz im Hirnventrikel. Die anti-Dld-Atto-647N injizierten Zebrafischembryonen zeigten große Mengen internalisierter fluoreszierender Partikel in den meisten Zellen des sich entwickelnden Vorderhirns. Zeitrafferaufnahmen zeigten die Bewegung intrazellulärer Anti-Dld-Atto-647N-Endosomen während der Zellteilung.
Die meisten mitotischen radialen Gliavorläuferzellen zeigten eine anteriore oder posteriore asymmetrische Segregation von anti-Dld-Atto-647N-Endosomen in zwei Tochterzellen. Die Asymmetrie stabilisierte sich gegen Ende der Anaphase, was zu einer asymmetrischen Vererbung von Notch-Signal-Endosomen durch die Tochterzellen führte. Stellen Sie sicher, dass die Nadel an der richtigen Stelle in den versteckten Markenventrikel eingeführt wurde, und prüfen Sie, ob nach der Mikroinjektion eine Leckage vorliegt.
Neben der Markierung des Notch-Delta-Signalwegs ist das Protokoll auch für die Markierung anderer Membranproteine oder extrazellulärer Proteine mit ähnlichen Strategien geeignet, wenn ein guter Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne verfügbar ist.
