Generierung von braunfettspezifischen Knockout-Mäusen unter Verwendung eines kombinierten Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus-Single-Guide-RNA-Systems

Dieses Protokoll erzeugt braunfettspezifische Knockout-Mäuse unter Verwendung eines Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- und Adeno-assoziierten Virus-Single-Guide-RNA-Systems. Es beinhaltet eine chirurgische Technik, um AAV sicher in das braune Fett zu verabreichen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie schnell gewebespezifische Knockouts erzeugen kann, ohne dass Mäuse selektiv gezüchtet werden müssen.

Der Ansatz zur Herstellung von gewebespezifischen Knockouts oder Knockdowns kann an andere Gewebe angepasst werden, wenn das chirurgische Verfahren zur Injektion von AAV auf der Grundlage des Zielorgans modifiziert wird. Verabreichen Sie das Analgetikum zunächst subkutan an die anästhesierte UCP1 Cre Cas9-Maus, um postoperative Schmerzen und Beschwerden zu minimieren und zu verhindern. Rasieren Sie dann das Fell im zwischenliegenden Bereich mit einem Rasierer und sterilisieren Sie den Operationsbereich mit mindestens drei abwechselnden Runden eines Peelings auf Jod- oder Chlorhexidinbasis, gefolgt von 70%igem Ethanol.

Machen Sie mit einem Skalpell einen zwei Zentimeter langen Schnitt in die Haut über dem braunen Fettgewebe zwischen den Schulterblättern, um das Zwischenkappelfett freizulegen. Nachdem Sie einen einzigen Schnitt gemacht haben, schneiden Sie das Fettgewebe an der Grenze zwischen der distalen Region des Fettgewebes und den Muskeln durch. Ziehen Sie dann mit der chirurgischen Schere in der dominanten Hand das Fettgewebe stumpf und vertikal ab, um das braune Fettgewebe freizulegen, während Sie das Fettgewebe, einschließlich des braunen Fettgewebes, mit der nicht dominanten Hand einklemmen.

Verwenden Sie die Sulzer-Vene als Orientierungspunkt, um die genaue Position des braunen Fettgewebes anzuzeigen. Als nächstes injizieren Sie für jede Maus langsam 20 Mikroliter Adeno-assoziiertes Virus oder AAV in jeden Lappen der beiden braunen Fettgewebe mit einer scharfen 32-Gauge-Nadel, die mit einer 100-Mikroliter-Hamilton-Spritze verbunden ist. Bestätigen Sie die erfolgreiche Injektion, die durch keine Leckagen an der injizierten Stelle während der AAV-Verabreichung angezeigt wird.

Nachdem Sie die Homöostase sichergestellt haben, bringen Sie das freiliegende Fettgewebe wieder in seine normale Position, um den Rand des Fettgewebes und des Muskels mit einem resorbierbaren 5-0-Monofilamentfaden zu nähen. Zum Schluss die offene Haut mit 5-0 beschichteten VICRYL ungefärbten Geflechtfäden vernähen. Die genaue Lage des braunen Fettgewebes kann nicht identifiziert werden, ohne es freizulegen, jedoch eine übermäßige Expositionsschädigung des Gewebes.

Zu den potenziellen Fehlern, die zu erfolglosen Injektionen geführt haben könnten, gehörten die Injektion der AAV-Lösung in die falsche Region, das Eindringen der Nadel in das Gewebe und das Aufblähen des Gewebes aufgrund eines übermäßigen Volumens der AAV-Lösung. Die präzise Abgabe von AAV-Einzelleit-RNA an das braune Fettgewebe war entscheidend für den Erfolg des Protokolls. Der Schlüssel zum Erfolg bei der Freilegung des braunen Fettgewebes ist die chirurgische Scherentechnik, einschließlich der Richtung und Tiefe der Schere und der Position der Hamilton-Spritze.

Diese Technik verfügt über eine belastungserzeugende gewebespezifische Knockout-Maschine, um die molekularen Regulatoren des mit braunem Fett verbundenen Energiestoffwechsels zu verstehen.