Dieses Protokoll stellt das SPH CRISPR-Aktivierungssystem als alternative Strategie zu herkömmlichen viralen Vektoren dar, um Gain-Function-Assays in Adipozyten durchzuführen. Es ermöglicht die Überexpression einzelner oder mehrerer endogener Gene von Adipozyten in der komplexen zellulären Umgebung des Fettgewebes, indem es eine maßgeschneiderte einzelne Leit-RNA unter Verwendung eines Adeno-assoziierten Virus liefert. Die herausfordernden Schritte dieses Protokolls beziehen sich auf die Klonierung der einzelnen Leit-RNA und die Produktion und Injektion von Adeno-assoziierten Viren in das Fettgewebe.
Entwerfen Sie zunächst eine RNA oder sgRNA mit einem einzigen Führer für die CRISPR-Aktivierung mit Chopchop oder einem anderen geeigneten Werkzeug. Design der sgRNA, die auf das PRDM16-Gen abzielt, unter Verwendung der folgenden Parameter:Target als PRDM16 in einem Mus musculus unter Verwendung eines CRISPR/Cas9 und zur Aktivierung. Fügen Sie der sgRNA Überhänge hinzu, die mit der Sac1-Restriktionsstelle im Vektor-Backbone PAAVU6GRNACBHM-Kirsche übereinstimmen.
5'AGCT 3' einschließen, wobei n Nukleotiden entspricht. Erhalten Sie die Reverse-Complement-Sequenz von 3'sgRNA mit dem angegebenen Werkzeug. Als nächstes werden zum Annealen von einzelsträngigen komplementären Oligonukleotiden ein Mikroliter jedes 5'- und 3'einzelsträngigen Oligonukleotids, ein Mikroliter T4-Ligasepuffer, 0,5 Mikroliter T4-Polynukleotidkinase und 6,5 Mikroliter Wasser für ein endgültiges Reaktionsvolumen von 10 Mikrolitern hinzugefügt.
Die komplementären einzelsträngigen Oligonukleotide werden mit einem Thermocycler bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten und bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten geglüht, gefolgt von einer Herunterfahrrate von fünf Grad Celsius pro Minute. Dann werden zur Ligation von getemperten sgRNA-Oligonukleotiden 25 Nanogramm Plasmid PAAVU6GRNACBHM-Kirsche zu zwei Mikrolitern getemperten sgRNA-Oligonukleotiden, einem Mikroliter Sac1-Enzym, zwei Mikrolitern 10X T4-DNA-Ligasepuffer, einem Mikroliter T4-DNA-Ligase und Wasser zu einem endgültigen Reaktionsvolumen von 10 Mikrolitern hinzugefügt. Führen Sie die Ligation mit einem Thermocycler durch, indem Sie das Reaktionsgemisch fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius und fünf Minuten lang bei 25 Grad Celsius inkubieren, gefolgt von einem Halten bei vier Grad Celsius.
Anschließend werden die kompetenten Escherichia coli DH10B-Zellen mit vier Mikrolitern des Ligationsprodukts durch Hitzeschock bei 42 Grad Celsius für 45 Sekunden transformiert und auf einer Agarplatte mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Ampicillin verteilt. Bestätigen Sie transformierte Kolonien durch Kolonie-Polymerase-Kettenreaktion oder PCR mit dem PCR-Master-Mix, wählen Sie die Kolonie und mischen Sie sie mit fünf Mikrolitern Master Mix, 0,1 Mikrolitern Universal-Primer, 0,1 Mikroliter sgRNA-Reverse-Primer und fünf Mikrolitern Wasser. Führen Sie die PCR mit einer anfänglichen Denaturierung bei 94 Grad Celsius für zwei Minuten durch, gefolgt von 35 Denaturierungszyklen bei 94 Grad Celsius für 20 Sekunden, Glühen für 30 Sekunden bei 60 Grad Celsius, Verlängerung bei 72 Grad Celsius für 30 Sekunden und einem letzten Dehnungsschritt bei 72 Grad Celsius für fünf Minuten.
Nach der PCR wird die DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese in 0,5-fachem TAE-Puffer bei 90 Volt für 30 Minuten aufgelöst. Reichen Sie positive Proben für die Sanger-Sequenzierung mit einem universellen Primer ein. Als nächstes reinigen Sie das Plasmid von einem positiven Klon mit einem Plasmid-Aufreinigungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Legen Sie die anästhesierte Maus in Rückenlage und rasieren Sie einen kleinen Bereich an den Flanken proximal der Hüftgelenke für inguinales weißes Fettgewebe oder IWAT-Injektionen mit einem Rasierer. Enthaarungscreme für fünf Minuten hinzufügen. Entfernen Sie die restliche Creme mit Wasser, um Hautverbrennungen zu vermeiden.
Desinfizieren Sie die Haut, indem Sie die Povidon-Jodlösung dreimal abwechselnd mit sauberer Gaze und 70%igem Alkohol auf die Haut auftragen. Machen Sie dann mit einer sterilisierten Schere einen ein bis zwei Zentimeter großen Schnitt im proximalen Bereich der Gelenke und halten Sie die Haut mit einer Pinzette offen, um das Fettdepot freizulegen. Das WAT kann beidseitig an der Haut befestigt werden und streckt sie von Anfang an vom Rücken bis zu den Hoden.
Ziehen Sie das Fettdepot mit einer Pinzette vorsichtig durch den Schnitt nach oben, um sicherzustellen, dass sich die Injektion an der richtigen Stelle und in der richtigen Tiefe befindet. Füllen Sie die Mikroliterspritze mit 2,5 Mikrolitern des Adeno-assoziierten Virus oder einem AAV, das die sgRNA enthält, die auf das endogene PRDM16-Gen abzielt. Führen Sie die Nadel vorsichtig in einem Winkel von 30-45 Grad in den IWAT ein.
Wiederholen Sie die Injektion fünfmal an verschiedenen Stellen des Gewebes, um das gesamte IWAT-Fettpolster homogen zu infizieren. Legen Sie die Maus auf das Heizkissen, bis das Bewusstsein wiedererlangt ist. Überwachen Sie das Tier alle 10 bis 15 Minuten, bis es sich vollständig erholt hat.
Nachdem das Tier das Bewusstsein wiedererlangt hat, beobachten Sie die Profilierung des Bewegungsapparates, die linear sein sollte und keine Anzeichen von Stress oder Schmerz aufweisen sollte. Sehen Sie sich die stromalen Gefäßzellen oder SVFs, die von der Adipo-SPH-Maus IWAT stammen, für ein bis zwei Stunden in eine 6-Well-Platte mit vollständigem DMEM-Medium ein, saugen Sie das Medium an, waschen Sie die Well-Vertiefung zweimal mit PBS und ersetzen Sie sie durch frisches, vollständiges Medium. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 95 % Luftfeuchtigkeit, bis die Zellen eine Konfluenz von 70-80 % erreichen.
Induzieren Sie an Tag 0 die Differenzierung, indem Sie die Zellen mit dem Induktionsmedium behandeln, und ersetzen Sie nach zwei Tagen das Induktionsmedium durch das Erhaltungsmedium. Ersetzen Sie nach zwei Tagen, am vierten Tag, das Pflegemedium für 2-3 Tage durch ein frisches Pflegemedium. Wechseln Sie das Erhaltungsmedium alle 48 Stunden, bis die Präadipozyten vollständig in Adipozyten differenziert sind.
Beobachten Sie die reifen Adipozyten lichtmikroskopisch, da die differenzierten Zellen mit Lipidtröpfchen beladen zu sein scheinen. Nachdem die Zellen auf einer 6-Well-Kulturplatte mit dem vollständigen Medium gezüchtet wurden, bis die Zellen eine Konfluenz von 70-80% erreicht haben, mischen Sie 5,6 * 10 ^ 10 virales Genom pro Mikroliter AAV-tragender sgRNA PRDM16 mit zwei Millilitern vollständigem Medium und Hexadimethrinbromid. Transduzieren Sie die Zellen, indem Sie das komplette Medium ersetzen und das komplette Medium hinzufügen, das AAV enthält.
Inkubieren Sie die transduzierten Zellen 12 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % Kohlendioxid. Teilen Sie die Zellen wie beschrieben für die Zellproliferation und -differenzierung in beige Adipozyten. Die Immunfluoreszenzbilder von IWAT von adipo SPH-Mäusen zeigten die Expression von dCas9 sowohl in der Kontroll- als auch in der PRDM16-Gruppe.
Die SPH-induzierte PRDM16-Expression induzierte eindeutig eine weit verbreitete Akkumulation von multiokulären beigen Adipozyten in IWAT. Darüber hinaus zeigte die quantitative PCR eine erhöhte Expression von PRDM16 und des thermogenen Genprogramms in der PRDM16-Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. In ähnlicher Weise bestätigte die in vitro Genexpressionsanalyse die erhöhte Expression des endogenen PRDM16-Gens und der thermogenen Gene in der PRDM16-Überexpressionsgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe.
Die SPH-induzierte PRDM16-Expression führte zu einem höheren basalen und maximalen Sauerstoffverbrauch als in Kontrollzellen. Wichtig ist, dass die Daten auf eine verbesserte ungekoppelte Atmung in der PRDM16-Gruppe im Vergleich zu der Kontrollgruppe hindeuteten. Das Adipo SPH-Modell eignet sich für die Untersuchung mehrerer Gene und regulatorischer Elemente innerhalb von Adipozyten.
Diese Methode eröffnet die Möglichkeit eines tieferen Verständnisses der Biologie von beigem Fett.
