Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (NFSC 82101224 to YG) unterstützt

Alle Tierversuche wurden vom Xi'an Jiaotong University Committee on the Use and Care of Animals genehmigt (Nr. 2021-847).
1. Sterilisation und Materialvorbereitung
<ol><li>Sterilisieren Sie die Präparierwerkzeuge mittels Hochtemperatur- und Hochdruck-Dampfdesinfektion und trocknen Sie sie über Nacht in einem 50 °C warmen Inkubator.</li>
	<li>100 ml des Nährmediums mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) und 10 mg/ml Penicillin/Streptomycin (10 ml FBS und 10 μl Penicillin-Stammlösung zu 90 ml Modified Eagle Medium (EMEM) von Dulbecco geben) im Voraus zubereiten und bei 4 °C lagern.</li>
</ol>2. Dissektion und Entfernung des Schläfenbeins zur Entnahme von Hörepithelien
<ol><li>Euthanasie einer Gesamtzahl von 10 neugeborenen Mäusen (im Alter zwischen P3 und P5) durch Enthauptung auf Eis. Verwenden Sie bei Bedarf eine alternative, ethisch anerkannte Methodik.</li>
	<li>Halten Sie den Kopf an Ort und Stelle, öffnen Sie die Kopfhaut entlang der sagittalen Naht mit einer Mikro-Operationsschere und trennen und fixieren Sie die Kopfhaut beidseitig mit den Fingern, wie in Abbildung 1A gezeigt.</li>
	<li>Entfernen Sie das Gehirn mit einem kleinen Periostlift und halbieren Sie den Basalschädel. Schneiden Sie den Schädel mit einer Schere ab und drehen Sie ihn nach vorne, um den Schädel zu öffnen. Benutze die Spitze der Schere, um das Gehirn abzukratzen und die Schädelbasis freizulegen.</li>
	<li>Beobachten Sie die bilateralen Schläfenknochen an der Schädelbasis (Abbildung 1C). Schneiden Sie mit einer Schere die Schädelbasis entlang der Mittellinie ab, kratzen Sie die Haut ab und entfernen Sie unnötigen Knochen (Abbildung 1D,D').</li>
	<li>Die Schläfenknochen werden aufbewahrt und in sterile 35-mm-Petrischalen mit frischer Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) überführt (Abbildung 1E).</li>
	<li>Verwenden Sie zwei #5-Pinzetten, um die Bulla und das umgebende Gewebe aus dem petrosen Teil des Schläfenbeins zu entfernen (Abbildung 1E). HINWEIS: In diesem Stadium wäre das knöcherne Labyrinth im Schläfenbein der Mäuse nicht vollständig verkalkt und würde leicht mit einer Pinzette präpariert werden können.</li>
	<li>Halten Sie die Pinzette mit einer Hand fest, um den halbkreisförmigen Teil des Schläfenbeins zu fixieren, und stecken Sie mit der anderen Hand den unteren Fuß der Pinzette in die runde Fensternische, um den lateralen Knochen der Cochlea vom Scala-Vestibulum zu trennen. Entfernen Sie vorsichtig den petrosen Teil des Schläfenbeins, ohne das OC-Epithel zu berühren. Anschließend wird das knöcherne Labyrinth der Cochlea vorsichtig vom basalen Ende bis zum apikalen Ende abgetrennt und entfernt (Abbildung 1F).</li>
	<li>Das Organ des sensorischen Corti-Epithels wird vorsichtig mit einer #5-Pinzette vom Modiolus isoliert (Abbildung 1G).</li>
	<li>Halten Sie das Spiralband fest, trennen Sie es vorsichtig mit einer mikrooperativen Pinzette von der Stria vascularis und übertragen Sie das saubere Hörepithel mit einer 200-μl-Pipette in eine 3 mm große sterile Kulturschale mit HBSS (Abbildung 1H).</li>
	<li>Entnehmen Sie 20 Proben von jedem Tier und überführen Sie sie schnell in eine sterile 100 mm Petrischale mit HBSS für den nächsten Präparationsschritt (Abbildung 1).</li>
</ol>3. Enzymatische Disaggregation zur Gewinnung von Hörhaarzellen
<ol><li>Das Hörepithel wird in 10 ml frisches DMEM mit 0,25 % Trypsin überführt und 12 Minuten lang bei 37 °C inkubiert.</li>
	<li>Mit einer 200-μl-Pipettenspitze die Haarzellen unter einem Operationsmikroskop vorsichtig von der Basallamina und anderen Zellen trennen.</li>
	<li>Fügen Sie weitere 10 ml Nährmedium hinzu, um die Disaggregation zu hemmen.</li>
	<li>Die suspendierten Zellen im Nährmedium werden durch einen 70-μm-Filter filtriert, das Filtrat in einem sauberen 50-ml-Röhrchen gesammelt und 5 Minuten lang bei 300 × g zentrifugiert.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Haarzellen in mindestens 5 ml Nährmedium, indem Sie sie mit einer 1.000-μl-Pipettenspitze vorsichtig auf und ab pipettieren. Vermeiden Sie das Einbringen von Blasen.</li>
	<li>Legen Sie im Voraus ein Deckglas auf den Boden einer Sechs-Well-Platte. Zählen Sie die Zellen und kultivieren Sie sie mit einer Dichte von 10bis 6 Zellen/ml in Sechs-Well-Platten.</li>
	<li>Die adhärenten Zellen werden in 2 ml DMEM (mit 10 % FBS, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin) bei 37 °C und 5 % CO2 gezüchtet. Wechseln Sie täglich das Nährmedium. HINWEIS: Es sollte erwähnt werden, dass die Verwendung dieses Protokolls nicht dazu führt, dass reine Haarzellen gewonnen werden. Basierend auf dieser primären Zellkulturmethode empfehlen wir die Verwendung von d2- oder d3-Zellen für weitere Studien, da Haarzellen etwa 70 % der Zellen in Kultur ausmachen und sich in einem guten Zustand befinden können.</li>
</ol>4. Immunfluoreszenz-Färbung
<ol><li>Entnehmen Sie die kultivierten Zellen von d1 bis d6 (eine Vertiefung pro Tag). Saugen Sie das Nährmedium ab und spülen Sie die Zellen 2x mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).</li>
	<li>Fixieren Sie die Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Entfernen Sie das Fixiermittel und spülen Sie die Zellen 3 x 3 min lang mit PBS.</li>
	<li>Permeabilisieren Sie die Zellen mit PBS mit 0,2% Triton X-100 für 10 min bei RT.</li>
	<li>Inkubieren Sie die permeabilisierten Zellen mit einer Blockierungslösung, die aus 10% FBS in PBS besteht, für 20 min bei RT.</li>
	<li>Färben Sie die Zellen mit monoklonalen Anti-Myosin-Antikörpern (verdünnt auf 1:200 in PBS) bei 4 °C über Nacht.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen 3x mit sterilem PBS und inkubieren Sie sie mit sekundären Antikörpern (Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit MYO7A, verdünnt 1:500 in PBS) und Fluorescein-markiertem Phalloidin (Alexa Fluor 488, zur Identifizierung der Zellstruktur) für 2 h bei RT.</li>
	<li>Spülen Sie die Zellen 3x mit PBS, um die Sekundärantikörper zu entfernen.</li>
	<li>Geben Sie 1-2 Tropfen Eindeckmedium mit DAPI auf die Objektträger, montieren Sie die Deckgläser und legen Sie sie unter ein konfokales Laserscanning-Mikroskop, um Fotos von den Zellen aufzunehmen.</li>
</ol>5. Statistische Analyse
<ol><li>Führen Sie eine Zwei-Wege-Varianzanalyse (ANOVA) durch, gefolgt von Tukey-Post-hoc-Tests, um die Veränderungen der Grauwerte von Myosin-VIIa und Phalloidin im Laufe der Zeit zu analysieren. Verwenden Sie die Buchstabenmarkierungsmethode, um statistische Unterschiede zu markieren.</li>
	<li>Führen Sie zusätzliche Einweg-ANOVAs durch, gefolgt von Tukeys Post-hoc-Tests, um das Phalloidin-positive Zellverhältnis zwischen Zellproben von Tag 1 bis Tag 6 und das Myosin-VII-positive Zellverhältnis an denselben Tagen zu vergleichen.</li>
</ol>

Effiziente In-vitro-Kultivierung von Cochlea-Haarzellen der Maus

<ol>
	<li>Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+structural+development+of+mammalian+Basilar+Membrane+provides+anatomical+basis+for+the+maturation+of+tonotopic+maps+and+frequency+tuning.">Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning.</a> Sci Rep. 11 (1), 7581 (2021).</li><li>Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochlear+hair+cells:+The+sound-sensing+machines.">Cochlear hair cells: The sound-sensing machines.</a> FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).</li><li>Joo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Contribution+of+Ototoxic+Medications+to+Hearing+Loss+Among+Older+Adults.">The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).</li><li>Nieman, C. L., Oh, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+Loss.">Hearing Loss.</a> Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).</li><li>Mao, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise-Induced+Hearing+Loss:+Updates+on+Molecular+Targets+and+Potential+Interventions.">Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions.</a> Neural Plast. 2021, 4784385 (2021).</li><li>Morioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearing+vulnerability+after+noise+exposure+in+a+mouse+model+of+reactive+oxygen+species+overproduction.">Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction.</a> J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+and+cytological+profiling+of+biological+aging+of+mouse+cochlear+inner+and+outer+hair+cells.">Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells.</a> Cell Rep. 39 (2), 110665 (2022).</li><li>Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Culture+of+Neonatal+Murine+Inner+Ear+Explants.">Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants.</a> Front Cell Neurosci. 13, 170 (2019).</li><li>Ding, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+ototoxicity+in+rat+cochlear+organotypic+cultures.">Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures.</a> Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).</li><li>Abitbol, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin-induced+ototoxicity+in+organotypic+cochlear+cultures+occurs+independent+of+gap+junctional+intercellular+communication.">Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 342 (2020).</li><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-VIIa+is+expressed+in+multiple+isoforms+and+essential+for+tensioning+the+hair+cell+mechanotransduction+complex.">Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex.</a> Nat Commun. 11 (1), 2066 (2020).</li><li>Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+auditory+HEI-OC1+cells.">Working with auditory HEI-OC1 cells.</a> J Vis Exp. (115), (2016).</li><li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea.">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> J Vis Exp. (107), (2016).</li><li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mouse+cochlear+progenitors+that+develop+hair+and+supporting+cells+in+the+organ+of+Corti.">Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti.</a> Nat Commun. 8, 15046 (2017).</li><li>Zheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prestin+is+the+motor+protein+of+cochlear+outer+hair+cells.">Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells.</a> Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).</li><li>Ruel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impairment+of+SLC17A8+encoding+vesicular+glutamate+transporter-3,+VGLUT3,+underlies+nonsyndromic+deafness+DFNA25+and+inner+hair+cell+dysfunction+in+null+mice.">Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice.</a> Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).</li><li>Seal, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensorineural+deafness+and+seizures+in+mice+lacking+vesicular+glutamate+transporter+3.">Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3.</a> Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).</li><li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+distinct+Atoh1+enhancers+cooperate+for+sound+receptor+hair+cell+development.">Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119 (2022).</li><li>Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEI-OC1+cells+as+a+model+for+investigating+drug+cytotoxicity.">HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity.</a> Hear Res. 335, 105-117 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Im Vergleich zur HEI-OC1-Zelllinie bildeten Primärkulturen von Haarzellen den physiologischen Zustand der Zellen in vivo genauer nach. Daher scheint die auditive Primärkulturmethode, bei der lebende Zellen aus Cochlea-Organen isoliert und sofort kultiviert werden, ein wertvolles Werkzeug für umfangreiche Forschungen am auditorischen System zu sein. Bestimmte Techniken sind entscheidend für eine erfolgreiche Kultur. Erstens erhöht die Minimierung der Dauer der Trennung des Corti-Organs vom Schläfenbein die Wahrschei...

Cochlea-Haarzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Schallerkennung und Signalübertragung an den Hörnerv. Haarzellen sind mechanistische Zellen, die als primäre Sinnesrezeptoren fungieren und Schallschwingungen in Wirbeltieren in elektrische Signale umwandeln. Das sensorische Epithel des Innenohrs von Säugetieren besteht aus einer einzigen Reihe innerer Haarzellen und drei Reihen äußerer Haarzellen. In verschiedenen basischen Membranbereichen nehmen Haarzellen Töne mit unterschiedlichen Frequenzen (zwischen 20 und 2.000 Hz) wahr1. Die Funktion der äußeren Haarzellen ist ein aktiver mechanischer Verstärkungsprozess, der bei der Feinabstimmung des Innenohrs von Säugetieren hilft und eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Geräuschen verleiht. Innere Haarzellen sind für die Erkennung von Geräuschen zuständig. Nach der abgestuften Depolarisation werden akustische Informationen über die Hörnervenfasern an das Gehirn weitergeleitet2.
Hörverlust kann durch genetische Defekte, Alterung, Lärmtraumata oder den übermäßigen Gebrauch von ototoxischen Medikamenten verursacht werden, die weltweit ein großes Gesundheitsproblem darstellen 3,4. Hörverlust resultiert hauptsächlich aus irreversiblen Schäden an Haarzellen5. In Bezug auf lärminduzierten Hörverlust haben sich die Forscher zwar über mehrere Details ihrer Ätiologie geeinigt, aber es fehlt ein umfassendes Verständnis der zahlreichen zugrunde liegenden Mechanismen. Äußere Haarzellen sind besonders anfällig für akustische Überbelichtung6. Mechanosensitive Cochlea-Haarzellen sind an altersbedingtem Hörverlust beteiligt. Die molekularen und zellulären Mechanismen, die der Degeneration von Haarzellen zugrunde liegen, sind jedoch noch unbekannt. Mehrere Veränderungen in den molekularen Prozessen führen zu Haarzellalterung, oxidativem Stress, DNA-Schadensreaktion, Autophagie und Dysregulation der Expression und Transkription von Genen, die mit der Spezialisierung von Haarzellen zusammenhängen7.
Da das Innenohr vom Schläfenbein tief im härtesten Knochen des Körpers umhüllt ist, ist es experimentell nicht zugänglich, was eine Herausforderung für die Erforschung der Mechanismen der Reparatur und Regeneration von Haarzellen darstellt. Die Etablierung von In-vitro-Kulturen zur Untersuchung der Funktion von Haarzellen ist daher zu einer idealen Methode geworden, um die Regenerations- und Verletzungsmechanismen des Innenohrs zu erforschen. Die Verfahren zur Herstellung von organotypischen Cochlea-Kulturen wurden in früheren Studienbeschrieben 8,9,10. Forscher auf der ganzen Welt haben verschiedene Techniken der Cochlea-Mikrodissektion und Oberflächenpräparation eingesetzt. Trotz der anhaltenden Herausforderungen konnten verschiedene primäre Haarzellkultursysteme erfolgreich in vitro etabliert werden. Cochlea-Organkulturen enthalten verschiedene Zelltypen, darunter Haarzellen, Deiters-Zellen, Hensen-Zellen, Säulenzellen und Hörnervenfasern. Ein tiefgreifendes Verständnis der Veränderungen in Haarzellen auf zellulärer und molekularer Ebene nach einer Verletzung wird die Entwicklung leistungsfähigerer Forschungswerkzeuge ermöglichen. Ziel dieser Studie war es, die Schritte zur Isolierung von Cochlea-Organen von neugeborenen Mäusen und zur enzymatischen Ablösung der reichlich vorhandenen Haarzellen für In-vitro-Studien zu demonstrieren. Die Beschaffenheit der kultivierten Zellen wurde durch Immunfluoreszenzfärbung bestätigt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm BioLite cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>130182</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Nunc cell culture dish</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well palate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>310109005</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cell strainers</td>
			<td>BD Company</td>
			<td>352350</td>
			<td>using for filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A12379</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientifc</td>
			<td>A11008</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>day 3-5 neonatal murine&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>provided by Xi&#39;an Jiaotong University</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11965092</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>5#</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica anatomy microscope</td>
			<td>Germany</td>
			<td>S9i</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit plyclonal to Myosin VIIa</td>
			<td>Abcam company</td>
			<td>ab92996</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td>Belevor</td>
			<td>10cm/04.0524.10</td>
			<td>using for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich&#160;</td>
			<td>9036-19-5</td>
			<td>immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td>using for culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary cochlear hair cells from neonatal mice

Cochlea-Haarzellen sind die sensorischen Rezeptoren des Hörsystems. Diese Zellen befinden sich im Corti-Organ, dem Sinnesorgan, das für das Hören zuständig ist, im knöchernen Labyrinth des Innenohrs. Cochlea-Haarzellen bestehen aus zwei anatomisch und funktionell unterschiedlichen Typen: äußeren und inneren Haarzellen. Eine Schädigung eines der beiden führt zu Hörverlust. Vor allem, da sich die inneren Haarzellen nicht regenerieren können und die Schäden an ihnen dauerhaft sind. Daher ist die In-vitro-Kultivierung von primären Haarzellen unabdingbar, um die schützende oder regenerative Wirkung von Cochlea-Haarzellen zu untersuchen. Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Haarzellen von Mäusen zu finden. 
Nach manueller Entfernung der Cochlea-Seitenwand wurde das Hörepithel unter einem Mikroskop sorgfältig aus dem Cochlea-Modiolus präpariert, 10 Minuten lang bei 37 °C in einer Mischung aus 0,25 % Trypsin-EDTA inkubiert und mit einer 200-μl-Pipettenspitze vorsichtig in einem Nährmedium suspendiert. Die Zellsuspension wurde durch einen Zellfilter geleitet, das Filtrat wurde zentrifugiert und die Zellen wurden in 24-Well-Platten kultiviert. Die Haarzellen wurden auf der Grundlage ihrer Fähigkeit identifiziert, einen Mechanotransduktionskomplex, Myosin-VIIa, zu exprimieren, der an motorischen Spannungen beteiligt ist, und durch selektive Markierung von F-Aktin unter Verwendung von Phalloidin. Die Zellen erreichten nach 4 Tagen in Kultur eine Konfluenz von >90 %. Diese Methode kann unser Verständnis der biologischen Eigenschaften von in vitro kultivierten Haarzellen verbessern und die Effizienz von Cochlea-Haarzellkulturen demonstrieren, wodurch eine solide methodische Grundlage für die weitere auditive Forschung geschaffen wird.

Cochlear hair cells play important roles in sound detection and signal transmission to the auditory nerve. Hair cells are mechanistic cells that function as primary sensory receptors and convert sound vibrations into electrical signals in vertebrates. The sensory epithelium of the mammalian inner ear comprises a single row of inner hair cells and three rows of outer hair cells. In different basic membrane areas, hair cells perceive sounds at different frequencies (between 20 and 2,000 Hz)1. The function of outer hair cells is an active mechanical amplification process that helps fine-tune the mammalian inner ear, conferring high sensitivity to sound. Inner hair cells are responsible for detecting sounds. After graded depolarization, acoustic information is transmitted to the brain through the auditory nerve fibers2.
Hearing loss may be caused by genetic defects, aging, noise trauma, or the excessive use of ototoxic drugs, which constitute a major health concern worldwide3,4. Hearing loss mainly results from irreversible damage to hair cells5. Regarding noise-induced hearing loss, although researchers have reached a consensus on several details of its etiology, a comprehensive understanding of the numerous underlying mechanisms is lacking. Outer hair cells are particularly vulnerable to acoustic overexposure6. Mechanosensitive cochlear hair cells are involved in age-related hearing loss; however, the molecular and cellular mechanisms underlying hair cell degeneration remain unknown. Several changes in the molecular processes lead to hair cell aging, oxidative stress, DNA damage response, autophagy, and dysregulation of the expression and transcription of genes related to hair cell specialization7.
As the inner ear is encased in the temporal bone, deep in the hardest bone of the body, it is experimentally inaccessible, posing a challenge to investigations into the mechanisms of hair cell repair and regeneration. Hence, establishing in vitro cultures for investigating the function of hair cells has become an ideal method for research on the regeneration and injury mechanisms of the inner ear. The procedures for preparing cochlear organotypic cultures have been described in earlier studies8,9,10. Investigators worldwide have employed various cochlear microdissection and surface preparation techniques. Despite the persistent challenges, various primary hair cell culture systems have been successfully established in vitro. Cochlear organ cultures contain various cell types, including hair cells, Deiters cells, Hensen&#39;s cells, pillar cells, and auditory nerve fibers. An in-depth understanding of the changes in hair cells at the cellular and molecular levels after injury will enable the development of more powerful research tools. This study aimed to demonstrate the steps for isolating cochlear organs from neonatal mice and enzymatically detaching the abundant hair cells for in vitro studies. The nature of the cultured cells was confirmed using immunofluorescence staining.

Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei der Kultivierung von Haarzellen von Mäusen für die auditive Forschung 

Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen aus neugeborenen Mäusen

The inner ear is encased in the temporal bone, deep in the hardest bone of the body, posing a challenging to investigations. The cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells.We demonstrate the steps for isolating cochlear organs from your natural mice and asymmetrically detaching the abundant hair cells for in-vitro studies. The nature of the cultured cells, was confirmed using immunofluorescence staining. There are three primary culture method established by isolating living cells from cochlear organs, and immediately coaching them, pair to be a valuable tool for extensive research, are all three system.This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in-vivo cultured hair cells, and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Nach diesem Protokoll haben wir die isolierten Zellen ausgesät. Primäre Cochlea-Haarzellsamen galten als erfolgreich, wenn die Zellen nicht im Nährmedium schwammen und sich innerhalb von 24 Stunden ausbreiteten. Wir bestimmten die Anzahl der Haarzellen, nachdem sie am Boden der Schale anhafteten und sich in flachen Aggregaten ausbreiteten. Nach 1 Tag wurden lebende Haarzellen fest an den Boden der Kulturschale geklebt und nicht anhaftende Zellen wurden durch Spülen mit PBS entfernt. Typischerweise verdoppelte sich di...

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In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von primären Cochlea-Haarzellen von Mäusen vor. Zunächst wurde das Corti-Organ aus neonatalen (3-5 Tage alten) murinen Cochleae unter dem Mikroskop präpariert. Anschließend wurden die Zellen enzymatisch zu einer Einzelzellsuspension verdaut und nach mehreren Tagen in Kultur mittels Immunfluoreszenz identifiziert.

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for ...

Das Innenohr ist vom Schläfenbein umhüllt, tief im härtesten Knochen des Körpers, was eine Herausforderung für die Untersuchung darstellt. Die Kultivierung von primären Haarzellen ist für die Untersuchung von Cochlea-Haarzellen unabdingbar. Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Haarzellen von Mäusen zu finden.Wir zeigen die Schritte zur Isolierung von Cochlea-Organen von Ihren natürlichen Mäusen und zur asymmetrischen Ablösung der reichlich vorhandenen Haarzellen für In-vitro-Studien. Die Beschaffenheit der kultivierten Zellen wurde durch Immunfluoreszenzfärbung bestätigt. Es gibt drei primäre Kulturmethoden, die durch die Isolierung lebender Zellen aus Cochlea-Organen und deren sofortiges Coaching etabliert werden, um ein wertvolles Werkzeug für umfangreiche Forschung zu sein, sind alle drei Systeme.Diese Methode kann unser Verständnis der biologischen Eigenschaften von in-vivo kultivierten Haarzellen verbessern und die Effizienz von Cochlea-Haarzellkulturen demonstrieren, was eine solide methodische Grundlage für die weitere auditive Forschung schafft.

isolation-culture-primary-cochlear-hair-cells-from-neonatal

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Biology

Isolation and Culture of Primary Cochlear Hair Cells from Neonatal Mice

1.6K Aufrufe.  The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University. Das Innenohr ist vom Schläfenbein umhüllt, tief im härtesten Knochen des Körpers, was eine Herausforderung für die Untersuchung darstellt. Die Kultivierung von primären Haarzellen ist für die Untersuchung von Cochlea-Haarzellen unabdingbar. Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Haarzellen von Mäusen zu finden.Wir zeigen die Schritte zur Isolierung von Cochlea-Organen von Ihren natürlichen Mäusen und zur asymmetrischen Ablösung der reichl...

Serie: Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei der Kultivierung von Haarzellen von Mäusen für die auditive Forschung 

Cochlear hair cells are the sensory receptors of the auditory system. These cells are located in the organ of Corti, the sensory organ responsible for hearing, within the osseous labyrinth of the inner ear. Cochlear hair cells consist of two anatomically and functionally distinct types: outer and inner hair cells. Damage to either of them results in hearing loss. Notably, as inner hair cells cannot regenerate, and damage to them is permanent. Hence, in vitro cultivation of primary hair cells is indispensable for investigating the protective or regenerative effects of cochlear hair cells. This study aimed to discover a method for isolating and cultivating mouse hair cells. 
After manual removal of the cochlear lateral wall, the auditory epithelium was meticulously dissected from the cochlear modiolus under a microscope, incubated in a mixture consisting of 0.25% trypsin-EDTA for 10 min at 37 &#176;C, and gently suspended in culture medium using a 200 &#181;L pipette tip. The cell suspension was passed through a cell filter, the filtrate was centrifuged, and cells were cultured in 24-well plates. Hair cells were identified based on their capacity to express a mechanotransduction complex, myosin-VIIa, which is involved in motor tensions, and via selective labeling of F-actin using phalloidin. Cells reached &gt;90% confluence after 4 d in culture. This method can enhance our understanding of the biological characteristics of in vitro cultured hair cells and demonstrate the efficiency of cochlear hair cell cultures, establishing a solid methodological foundation for further auditory research.

Herein, we present a detailed protocol for isolating and culturing primary cochlear hair cells from mice. Initially, the organ of Corti was dissected from neonatal (aged 3-5 days) murine cochleae under a microscope. Subsequently, cells were enzymatically digested into a single-cell suspension and identified using immunofluorescence after several days in culture.

Forschung

Biologie

Dissection and Removal of the Temporal Bone to Collect Auditory Epithelia from Newborn Mice

To begin, securely hold the head of the euthanized newborn mice in place. Using micro operating scissors, open the scalp along the sagittal suture. Then, separate and immobilize the scalp bilaterally with the fingers.Use scissors to sever the cranium and flip it forward to access the skull. Employ a small periosteal elevator to extract the brain and then use the tip of the scissors to gently scrape the brain, revealing the base of the skull. Now, examine the bilateral temporal bones at the skull's base.Employ scissors to incise the base of the skull along the midline. Then, scrape off the skin and eliminate any unnecessary bone. Preserve and transfer the temporal bones to 35-millimeter sterile Petri dishes filled with fresh HBSS.Next, use a pair of 5 number pointed forceps to eliminate the bola and surrounding tissue from the petrous portion of the temporal bone. Hold the forceps with one hand to stabilize the semi-circular part of the temporal bone. Use the other hand to insert the lower tip of the forceps into the round window niche, separating the lateral bone of the cochlea from the scale of vestibule.Carefully remove the petrous portion of the temporal bone without contacting the Organ of Corti epithelium. Then, meticulously detach and extract the bony labyrinth of the cochlea, starting from the basal to the apical end. Using 5 number pointed forceps, carefully micro isolate the sensory epithelium of the Organ of Corti from the modiolus.Next, employ micro-operating forceps to hold the spiral ligament, and gently separate it from the stria vascularis. Transfer the clean auditory epithelium, using a 200 microliter pipette, to a three millimeter sterile culture dish containing HBSS. Place the isolated auditory epithelium in a 100 millimeter sterile Petri dish filled with HBSS for the subsequent preparation steps.

Dissektion und Entfernung des Schläfenbeins zur Gewinnung von Hörepithelien von neugeborenen Mäusen

Enzymatic Disaggregation of the Auditory Epithelium to Obtain Auditory Hair Cells

To begin, isolate the auditory epithelium from the temporal bone of newborn mice and transfer it to 10 milliliters of fresh DMEM containing 0.25%Trypsin, incubate the mixture at 37 degrees Celsius for 12 minutes. Using a 200 microliter pipette tip, gently separate the hair cells from the basal lamina and other cells using an operating microscope. Then add another 10 milliliters of culture medium to inhibit the disaggregation.Filter the suspended cells through a 70 micrometer filter. Collect the filtrate in a clean 50 milliliter tube and centrifuge it at 300G for five minutes. Using a 1000 microliter pipette tip, re suspend the hair cells in five milliliters of culture medium by gentle pipetting.Now place a cover slip at the bottom of a six well plate in advance. Count the cells and culture them at 10 to the sixth cells per milliliter density in the six well plate, grow the adherence cells in two milliliters of DMEM at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. After one day of culturing the hair cells adhered firmly to the bottom of the dish.By the third day, the number of cells had doubled.