Schmeißfliegen sind eine vielfältige Gruppe von Fliegen, die obligate oder fakultative Parasiten sowie sapro-nekrophage Parasiten sein können. Obligate parasitäre Arten ernähren sich ausschließlich von lebendem Gewebe und verursachen Myiasis bei Wirbeltieren, während sapro-nekrophage Arten sich von verrottendem organischem Material ernähren. Fakultative Parasiten können sich sowohl von lebendem als auch von verwesendem Material ernähren und als Parasiten leben oder nicht.
Obwohl das Larvenstadium das problematischste ist, spielt das Weibchen eine entscheidende Rolle, da es den Ort der Eiablage wählt und somit weitgehend kontrolliert, wo sich die Larven ernähren und entwickeln werden. Das übergeordnete Ziel der hier vorgestellten Methoden ist es, sowohl die Nahrungssubstratpräferenz der Larven als auch die Wahl des weiblichen Eiablageplatzes bei Schmeißfliegen zu beurteilen. Bevorzugte Fütterung der Larven.
Schritt eins, Zubereitung der Petrischalen mit Agar 2%Petrischalen mit 2%Agar zubereiten. Dazu fügen Sie sechs Gramm bakteriologischen Agar in 300 Milliliter Wasser hinzu und schmelzen diese Mischung in der Mikrowelle. Anschließend teilen Sie das Volumen in vier Petrischalen auf.
Bereiten Sie die Anzahl der Petrischalen mit Agar-Agar entsprechend der Anzahl der gewünschten Replikate vor. Nachdem der Agar erstarrt ist, stanzen Sie vier Löcher in den Agar mit dem in unserem Papier enthaltenen Schneidepetter in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit einem Durchmesser von drei Zentimetern, zwei Löcher auf jeder Seite der Petrischale. Schritt zwei: Vorbereitung der Substrate.
Um das frische Fleisch mit Blut zuzubereiten, verwenden Sie 12 Milliliter verdünntes Rinderblut, das zur Hälfte aus Blut mit gerinnungshemmender Lösung und zur Hälfte aus gefiltertem Wasser besteht. Geben Sie diese Lösung dann zu 200 Gramm frischem Rinderhackfleisch und rühren Sie es gut um. Denken Sie daran, für jede Fleischsorte unterschiedliche Gradmesser und Löffel zu verwenden, um weitere Verunreinigungen zwischen den Substraten zu vermeiden.
Um das faule Substrat vorzubereiten, geben Sie 12 Milliliter gefiltertes Wasser in 200 Gramm verdorbenes Fleisch und rühren Sie es genauso um, wie es mit dem frischen Fleisch gemacht wurde. Vor Beginn des Experiments wird das Fleisch fünf Tage lang bei 25 Grad Celsius in einem Inkubator verrotten gelassen. Nachdem Sie das Fleischsubstrat vorbereitet haben, füllen Sie die Löcher im Agar auf jeder Seite mit frischem und faulem Fleisch.
Denken Sie daran, die Position des Fleisches in den Petrischalen zufällig zu bestimmen, wie wir es hier zeigen. Schritt drei: Versuchsaufbau. Stellen Sie das Heizkissen in einem Raum bei 25 Grad Celsius direkt unter eine Lichtquelle, um den Präferenz-Assay gleichmäßig in einer breiten Verhaltensverzerrung zum oder gegen das Licht auszuleuchten.
Verwenden Sie dann Pappe um das Heizkissen herum als Stütze, um alles auf der gleichen Höhe zu halten. Legen Sie eine schwarze Pappe über das gesamte Set, das Heizkissen und die Stützpappe, um das gleiche Farbmuster über allen Substraten zu erhalten. Stellen Sie sechs Petrischalen mit Agar-Agar und Fleischsubstrat auf den schwarzen Karton mit zwei Substraten, eines von jeder Art auf dem Heizkissen und die anderen beiden außerhalb der Heizkissenoberfläche.
Auf diese Weise lassen wir zu, dass jede der Petrischale vier Substrate hat: frisch und kalt, faul und kalt, frisch und heiß und schließlich faul und heiß. Lassen Sie das Substrat ca. 10 Minuten erhitzen. Schritt vier, Larventest.
Überprüfen Sie die Temperatur des Substrats mit einem Infrarot-Thermometer. Die kältere Seite sollte bei etwa 25 Grad Celsius und die heißere bei etwa 33 Grad Celsius liegen. Nachdem Sie die gewünschte Temperatur erreicht haben, legen Sie mit einer Pinzette fünf dritte Larven in die Mitte jeder Petrischale.
Dann die Petrischale mit dem Deckel abdecken und das Auswahlexperiment genau 10 Minuten laufen lassen. Während des Experiments krabbeln die Larven um die Petrischale herum und wählen eine der vier Optionen. Wenn Larven entweichen, nehmen Sie sie mit einer Pinzette und legen Sie sie zurück in die Mitte der Petrischale.
Nach 10 Minuten alle Experimentier-Petrischalen aus dem Heizkissen nehmen und auf eine andere Unterlage stellen. Zählen Sie dann, wie viele Larven sich in jedem Substrat befinden. Wir haben beobachtet, dass bunte Larven in ihrem gewählten Substrat bleiben.
Präferenz für die Eiablagestelle des Weibchens. Schritt eins: Versuchsaufbau. Die Aufgabe kann auf einem normalen Regal erledigt werden, das zuvor mit schwarzen Kartons abgedeckt war.
Diese Pappen werden, genau wie bei einem Larven-Assay, benötigt, so dass für die erwachsenen Weibchen keine visuellen Hinweise zur Verfügung stehen. Außerdem muss das Regal gleichmäßig mit LED-Streifen ausgekleidet werden. Legen Sie in einem Raum bei 25 Grad Celsius das Heizkissen in die Mitte des Regals.
Verwenden Sie Pappe um das Heizkissen herum als Stütze, um alles auf dem gleichen Niveau zu halten. Legen Sie einen schwarzen Karton über das gesamte Set, ein Heizkissen und Stützpappe, um das gleiche Farbmuster über allen Substraten zu erhalten. Positionieren Sie die Heizkissen unter zwei Armen desselben Kreuzes zwischen zwei verschiedenen Kreuzen.
Dadurch kann der Platz im Regal besser genutzt werden. Schalten Sie die LED-Leuchten und das Heizkissen vor Beginn des Experiments ein. Denken Sie daran, die kreuzförmigen Gläser immer mit 70%igem Ethanol zu reinigen, um eine Geruchskontamination zwischen den Tests zu vermeiden.
Schritt zwei: Vorbereitung der Substrate. Bereiten Sie die Plastik-Petrischalen mit fünf Gramm frischem oder verdorbenem Fleisch zu. Das Substrat ist das gleiche wie beim Larventest, frisch und fünf Tage alt, verfault.
Für jedes Kreuz werden insgesamt vier Petrischalen benötigt, zwei mit frischem Fleisch und zwei mit verdorbenem Fleisch. Für das frische Fleisch fügen Sie einen Millimeter verdünntes Rinderblut hinzu, das zur Hälfte aus gerinnungshemmendem Blut und zur Hälfte aus Wasser besteht. Für das verdorbene Fleisch einen Millimeter gefiltertes Wasser hinzugeben.
Denken Sie daran, beide Substrate gut umzurühren und verschiedene Löffel zu verwenden, um eine Geruchskreuzkontamination zwischen verdorbenem und frischem Fleisch zu vermeiden. Prüfen Sie, ob der Alkohol an den Kreuzen vollständig verdunstet ist. Stellen Sie dann vier Petrischalen mit Fleisch an die Enden der gekreuzten Arme, eine von jeder Fleischsorte auf das Heizkissen und die anderen beiden außerhalb der Heizkissenoberfläche.
Auf diese Weise kann jedes der Kreuze vier Substrate haben: frisch und kalt, faul und kalt, frisch und heiß und schließlich faul und heiß. Die Öffnung der Kreuze verschließen und die Substrate ca. 10 Minuten erhitzen lassen. Schritt drei, weiblicher Test.
Sammle ein Weibchen im Fliegenkäfig. Sie zeichnen sich durch einen vergrößerten und weißlich-gelben Hinterleib aus. Trennen Sie eine Buchse für jedes Kreuz in einzelnen Röhren.
Überprüfen Sie die Temperatur der Substrate mit einem Infrarot-Thermometer. Die kältere Seite sollte bei etwa 25 Grad Celsius und die heißere bei etwa 33 Grad Celsius liegen. Lege ein Röhrchen mit einem gegriffenen Weibchen direkt in die mittlere Öffnung jedes Kreuzes.
Nachdem das Weibchen das Kreuz betreten hat, schließen Sie die Öffnung mit dem Deckel. Nachdem Sie alle Weibchen in jedes Kreuz gelegt haben, schließen Sie den offenen Teil des Regals mit der schwarzen Pappe, um sie vor externen Lichtquellen zu schützen. Lassen Sie das Experiment genau vier Stunden laufen.
Nach Ablauf dieser Zeit wird das Weibchen mit einem Schlauch von den Kreuzen entfernt. Prüfen Sie dann, ob es eine andere Position auf dem Substrat gab. Identifizieren Sie den Deckel jeder Petrischale mit dem Namen des Substrats.
Verwenden Sie 70%iges Ethanol, um die Kreuze von jeglichem Geruch aus dem Test zu reinigen. Schritt vier: Eier zählen. Die Petrischalen können vor dem Zählen eingefroren werden.
In diesem Fall die Petrischalen auftauen. Zählen Sie dann die Anzahl der Eier in jedem Substrat mit einem Stereomikroskop. Datenanalyse und Statistik.
Schritt eins: Berechnung des Präferenzindexes. Für jede Wiederholung der Verhaltenstests wird ein Präferenzindex separat für die Art des Substrats und für die Temperatur berechnet. Der Präferenzindex für den Substrattyp wird durch die Anzahl der Larven oder Eier auf Frischfleischsubstraten dividiert durch die Gesamtzahl der Larven oder Eier auf allen Substraten dargestellt.
Der Präferenzindex für die Temperatur wird durch die Anzahl der Larven oder Eier auf heißen Substraten geteilt durch die Gesamtzahl der Larven oder Eier auf allen Substraten dargestellt. Unter Berücksichtigung beider Indexpräferenzen spiegeln Werte nahe eins die Präferenz für frische oder heiße Substrate wider. Und Werte nahe Null bedeuten die Bevorzugung von faulen oder kalten Substraten.
Schritt zwei: Vergleich der beobachteten Präferenz mit der Zufallswahl. Wir können den Präferenzindex für die Temperatur auf der Y-Achse und den Präferenzindex für das Fleisch auf der X-Achse visualisieren. Um festzustellen, ob die Larven und/oder Weibchen eine Präferenz für eine Erkrankung zeigen, verglichen wir unsere Ergebnisse mit einer zufälligen Auswahl unter Verwendung simulierter Daten.
Unsere Larvenergebnisse unterschieden sich signifikant von allen simulierten Datensätzen in Bezug auf Temperatur und Fleischpräferenz. Grafisch ist ersichtlich, dass die Larven eine starke Vorliebe für das faule und kalte Substrat zeigten. Wir fanden heraus, dass sich die weibliche Präferenz für eine Fleischsorte in etwa 30% der Vergleiche signifikant von einer zufälligen Wahl unterschied.
Bei der Temperatur ergaben rund 70 % unserer Vergleiche eine signifikante Präferenz. Beide Protokolle bieten die Möglichkeit, die Präferenz von Larven und Weibchen für zwei interagierende Faktoren, die Fleischsorte und die Temperatur, zu testen. Die Tests sind unkompliziert und können angepasst werden, um die Präferenz anderer Arten der gleichen Größe und/oder anderer Bedingungen zu testen.
Wir wissen, dass das Verhalten von Tieren sehr variabel ist und von mehreren Umweltfaktoren beeinflusst wird, daher sollte besonders darauf geachtet werden, ungleichmäßige Beleuchtung, anhaltende Gerüche und andere Verunreinigungen des Substrats durch gemeinsam genutzte Utensilien zu vermeiden. Danke fürs Zuschauen.
