I moscerini sono un gruppo eterogeneo di mosche che possono essere parassiti obbligati o facoltativi, oltre che sapro-necrofagi. Le specie parassite obbligate si nutrono esclusivamente di tessuti viventi e causano miasi nei vertebrati, mentre le specie sapro-necrofaghe si nutrono di materia organica in decomposizione. I parassiti facoltativi possono nutrirsi sia di materiale vivente che in decomposizione e vivere come parassiti o meno.
Sebbene lo stadio larvale sia il più problematico, la femmina gioca un ruolo decisivo in quanto sceglie dove deporre e quindi controlla in gran parte dove le larve si nutriranno e si svilupperanno. L'obiettivo generale dei metodi qui presentati è quello di valutare sia la preferenza del substrato alimentare larvale che la scelta del sito di ovideposizione femminile nei moscerini. Preferenza per l'alimentazione larvale.
Fase uno, preparazione delle piastre di Petri con agar 2%Preparare le piastre di Petri con 2%agar. Per fare ciò, aggiungi sei grammi di agar batteriologico a 300 millilitri di acqua e sciogli questa miscela in un microonde. Quindi dividere il volume in quattro piastre di Petri.
Preparare il numero di piastre di Petri con agar in base al numero di repliche desiderate. Dopo che l'agar si è solidificato, praticare quattro fori nell'agar utilizzando il petter da taglio fornito nella nostra carta in un tubo conico da 50 millilitri con un diametro di tre centimetri, due fori su ciascun lato della piastra di Petri. Fase due, preparazione dei substrati.
Per preparare la carne fresca con il sangue, utilizzare 12 millilitri di sangue bovino diluito, metà sangue con una soluzione anticoagulante e metà acqua filtrata. Quindi aggiungere questa soluzione a 200 grammi di carne macinata bovina fresca e mescolare bene. Ricordati di utilizzare cilindri e cucchiai graduati diversi per ogni tipo di carne per evitare altre contaminazioni tra i substrati.
Per preparare il substrato marcio, aggiungere 12 millilitri di acqua filtrata a 200 grammi di carne marcia e mescolare proprio come si faceva con la carne fresca. Prima dell'inizio dell'esperimento, la carne viene lasciata marcire per cinque giorni a 25 gradi Celsius in un'incubatrice. Dopo aver preparato il substrato di carne, riempi i fori nell'agar con carne fresca e marcita su ciascun lato.
Ricordati di randomizzare la posizione della carne nelle piastre di Petri come mostriamo qui. Fase tre, configurazione sperimentale. In una stanza a 25 gradi Celsius, posizionare il termoforo proprio sotto una fonte di luce per illuminare uniformemente il test di preferenza con un'ampia polarizzazione di comportamento verso o contro la luce.
Quindi usa il cartone intorno al termoforo come supporto per mantenere tutti allo stesso livello. Posiziona un cartoncino nero su tutto il set, il termoforo e il cartone di supporto, per mantenere lo stesso motivo di colore sopra tutti i substrati. Posizionare sei piastre di Petri con agar e substrato di carne sul cartone nero con due substrati, uno di ciascun tipo sul termoforo e gli altri due all'esterno della superficie del termoforo.
In questo modo, consentiremo a ciascuna delle piastre di Petri di avere quattro substrati, fresco e freddo, marcio e freddo, fresco e caldo e, infine, marcio e caldo. Lasciare riscaldare il substrato per circa 10 minuti. Fase quattro, test larvale.
Controllare la temperatura del substrato con un termometro a infrarossi. Il lato più freddo dovrebbe essere a circa 25 gradi Celsius e il più caldo a circa 33 gradi Celsius. Dopo aver raggiunto la temperatura desiderata, posizionare cinque larve di terzo stadio al centro di ciascuna capsula di Petri usando una pinzetta.
Quindi copri la capsula di Petri con il coperchio e lascia che l'esperimento scelto venga eseguito per 10 minuti esatti. Durante l'esperimento, le larve strisciano intorno alla capsula di Petri e scelgono tra le quattro opzioni. Se qualche larva fuoriesce, prendila usando una pinzetta e rimettila al centro della capsula di Petri.
Dopo 10 minuti, estrai tutte le piastre di Petri dagli esperimenti dal termoforo e posizionale su una superficie diversa. Quindi conta quante larve ci sono in ogni substrato. Abbiamo osservato che le larve colorate rimangono nel substrato prescelto.
Preferenza del sito di ovideposizione femminile. Primo passo, configurazione sperimentale. Il compito può essere svolto su un normale scaffale che in precedenza era coperto da cartoni neri.
Questi cartoni, proprio come in un saggio larvale, sono necessari, quindi non sono disponibili segnali visivi per le femmine adulte. Anche lo scaffale deve essere rivestito uniformemente con strisce LED. In una stanza a 25 gradi Celsius, posizionare il termoforo al centro dello scaffale.
Usa il cartone intorno al termoforo come supporto per mantenere tutti allo stesso livello. Posiziona un cartoncino nero su tutto il set, un termoforo e un cartoncino di supporto per mantenere lo stesso motivo colorato sopra tutti i substrati. Posizionare i termofori sotto due bracci della stessa croce tra due croci diverse.
Ciò consentirà un migliore utilizzo dello spazio nello scaffale. Accendi le luci LED e il termoforo prima dell'inizio dell'esperimento. Ricordarsi di pulire sempre i bicchieri a forma di croce con etanolo al 70% per evitare la contaminazione degli odori tra un test e l'altro.
Fase due, preparazione dei substrati. Preparare le piastre di Petri di plastica con cinque grammi di carne fresca o marcia. Il substrato è lo stesso del test larvale, fresco e marcio di cinque giorni.
Per ogni incrocio sono necessarie un totale di quattro piastre di Petri, due con carne fresca e due con carne marcia. Per la carne fresca, aggiungere un millimetro di sangue bovino diluito che è metà del sangue con anticoagulante e metà dell'acqua. Per la carne avariata, aggiungere un millimetro di acqua filtrata.
Ricordati di mescolare bene entrambi i substrati e di utilizzare cucchiai diversi per evitare la contaminazione incrociata degli odori tra carne marcia e fresca. Controlla se l'alcol è completamente evaporato sulle croci. Quindi posizionare quattro piastre di Petri con carne all'estremità delle braccia delle croci, una per ogni tipo di carne sul termoforo e le altre due all'esterno della superficie del termoforo.
Ciò consentirà a ciascuna delle croci di avere quattro substrati, fresco e freddo, marcio e freddo, fresco e caldo e, infine, marcio e caldo. Chiudere l'apertura delle croci e lasciare scaldare i substrati per circa 10 minuti. Fase tre, test femminile.
Raccogli afferra una femmina nella gabbia delle mosche. Sono caratterizzati dall'avere un addome ingrossato e di colore giallo biancastro. Separare una femmina per ogni croce nei singoli tubi.
Controllare la temperatura dei substrati con un termometro a infrarossi. Il lato più freddo dovrebbe essere a circa 25 gradi Celsius e il più caldo a circa 33 gradi Celsius. Posiziona un tubo con una femmina afferrata proprio nell'apertura centrale di ogni croce.
Dopo che la femmina è entrata nella croce, chiudere l'apertura con il coperchio. Dopo aver posizionato tutte le femmine in ogni croce, chiudere la parte aperta del ripiano con il cartoncino nero per schermare dalle fonti di luce esterne. Lascia che l'esperimento venga eseguito per quattro ore esatte.
Trascorso questo tempo, rimuovere la femmina dalle croci usando un tubo. Quindi controlla se c'erano altre posizioni sul substrato. Identifica il coperchio di ogni capsula di Petri con il nome del substrato.
Usa etanolo al 70% per pulire le croci da qualsiasi odore del test. Fase quattro, conteggio delle uova. Le piastre di Petri possono essere congelate prima del conteggio.
In questo caso, scongelare le piastre di Petri. Quindi, contare il numero di uova in ciascun substrato usando uno stereomicroscopio. Analisi dei dati e statistiche.
Primo passo, calcolo dell'indice di preferenza. Per ogni replica dei test comportamentali viene calcolato separatamente un indice di preferenza per il tipo di substrato e per la temperatura. L'indice di preferenza per il tipo di substrato è rappresentato dal numero di larve o uova su substrati di carne fresca diviso per il numero totale di larve o uova su tutti i substrati.
L'indice di preferenza per la temperatura è rappresentato dal numero di larve o uova su substrati caldi diviso per il numero totale di larve o uova su tutti i substrati. Considerando entrambe le preferenze dell'indice, i valori vicini a uno riflettono la preferenza per i substrati freschi o caldi. E valori vicini allo zero indicano la preferenza per substrati marci o freddi.
Fase due, confronto tra la preferenza osservata e la scelta casuale. Possiamo visualizzare l'indice di preferenza per la temperatura sull'asse Y e l'indice di preferenza per la carne sull'asse X. Per determinare se le larve e/o le femmine mostrano una preferenza per una condizione, abbiamo confrontato i nostri risultati con una scelta casuale utilizzando dati simulati.
I risultati delle nostre larve differiscono significativamente da tutti i set di dati simulati in termini di temperatura e preferenza per la carne. Graficamente, è evidente che le larve hanno mostrato una forte preferenza per il substrato marcio e freddo. Abbiamo scoperto che la preferenza femminile per un tipo di carne era significativamente diversa da una scelta casuale in circa il 30% dei confronti.
Per quanto riguarda la temperatura, circa il 70% dei nostri confronti ha dato luogo a una preferenza significativa. Entrambi i protocolli offrono la possibilità di testare la preferenza delle larve e delle femmine per due fattori interagenti, il tipo di carne e la temperatura. I test sono semplici e possono essere adattati per testare la preferenza di altre specie della stessa dimensione e/o altre condizioni.
Sappiamo che il comportamento degli animali è piuttosto variabile e influenzato da diversi fattori ambientali, quindi è necessario prestare particolare attenzione per evitare un'illuminazione disuguale, odori persistenti e altre contaminazioni del substrato attraverso utensili condivisi. Grazie per l'attenzione.
