Diese Arbeit wird durch den Wellcome Trust, The Medical Research Council, The Royal Society, Birmingham Science City und die Unfruchtbarkeit Research Trust finanziert. Wir möchten die fachkundige Unterstützung von Cairn Research in den Bau und die Integration der Imaging-Rigs bestätigen.

Sperma von gesunden fruchtbaren Männchen, mit einem normalen Spermiogramm, sind in der Regel für die Bildgebung wie folgt hergestellt. <ol><li> Semen Proben werden bei 37 ° C nicht länger als 30 min gespeichert. 1,8 CaCl 2 .2 H 2 O, 5,37 KCl, 0,81 MgSO 4 .7 H 2 O, 26,2 NaHCO 3, 1,0 NaH 2 PO 4: mM; Zellen werden aus der Samenflüssigkeit von Swim-up in ergänzt balanced salt Earle-Lösung (sEBSS isoliert. 2H 2 O, 116,4 NaCl, 55,6 D-Glucose, 2,73 Na-Pyruvat, 41,8 Na-Lactat) mit 0,3% Holzkohle de-lipidated/fatty säurefrei Fraction V BSA (Qualität der BSA ist Voraussetzung für erfolgreiche Kapazitation der Spermien) ergänzt. 1 ml der sEBBS ist in jedem der eine Reihe von 5 ml pipettiert und vorsichtig mit 0,3 ml des Samens underlayered. Nach einer Inkubationszeit von 1 Stunde (37 ° C, 6% CO 2) der oberen 0,7 ml wird sanft aus jedem Rohr entfernt und gepoolt. 10 ul der Spermien-Suspension mit 90 ul 1% (v / v) Formalin, um die Zellen zu immobilisieren verdünnt wird, dann Spermien werden in einer Neubauer-Kammer gezählt. Die Zelldichte in der Suspension wird dann angepasst (mit sEBSS) bis 6 Millionen Zellen / ml. </li><li> In für 5-6 h auf Kapazitation zu ermöglichen.; Die Probe wird dann in Aliquots von 200 ul in locker-Röhrchen mit und inkubiert (6% CO 2 37 ° C) unterteilt </li><li> Deckgläser (22X50 mm) haben zuvor mit Poly-D-Lysin behandelt worden. 10 ul der Poly-D-Lysin-Lösung (10% w / v) wird als eine Reihe von kleinen Tropfen in die Mitte des Deckglases aufgetragen. Die Poly-D-Lysin wird dann an der Luft getrocknet. Dies kann auf einem beheizten Bühne zu stehen und sollte bis zur vollständigen Trockne. . Ähnlich wie die Warner RC20 Kammer Die Poly-D-Lysin, einem Deckglas wird mit Vakuum-Fett auf einem geschlossenen, für diesen Zweck gebaut, perfundierbaren, Polycarbonat Bildgebung Kammer (Kapazität ≈ 180 ul Abmessungen 35 mm x 20 mm x 5 mm) befestigt beschichteten Deckglas bildet die Basis der Kammer, wenn die Zellen auf einem inversen Mikroskop betrachtet und ein 12 mm Durchmesser kreisförmigen Deckglas bildet die Oberseite der Kammer, so dass Lichtdurchlässigkeit. </li><li> Oregon Green BAPTA1-AM (OGB) oder Calcium Green 1-AM für die Markierung von Zellen eingesetzt. OGB wird durch Lösen in DMSO. Pluronic F127 Säure (ein Waschmittel) ist in der DMSO aufgenommen, um &quot;Verklumpung&quot; des Farbstoffes zu verhindern. Dies kann im Labor (100 mg Pluronic in 0,5 ml DMSO) hergestellt werden, unmittelbar vor dem Gebrauch oder kann bestellt vorbereitete werden. 20 pl ist es, eine 50 ug Aliquot OGB (2,5 mg / ml) aufgenommen. Das Fläschchen kann dann gespeichert werden eingefroren und wieder aufgetaut für den späteren Gebrauch werden. </li><li> Nach Kapazitation der Spermien (5-6 h in sEBBS, 37 ° C, 6% CO 2) ein Rohr für die Bildgebung und 1,2 ul der OGB-Lösung ausgewählt wird, wird hinzugefügt, was zu einer Endkonzentration von 10 uM. Das Rohr wird dann für weitere 40 min inkubiert, wonach die Zellsuspension vorsichtig in die Einströmöffnung der Bildgebung Kammer mit einem p1000 (blau) Pipettenspitze injiziert. Die Kammer ist in den Inkubator, Poly-D-Lysin-beschichtete Deckglas nach unten, für 20 min gestellt. Zellen neigen dazu, entlang der Oberflächen der Kammer schwimmen und wird dem Poly-D-Lysin-beschichtete Fläche haften. </li><li> Die Kammer ist nun auf dem Mikroskop montiert, angeschlossen an die Perfusionsapparatur und perfundierten mit ca. 0,5 ml / min. Eine Walze Pumpe fördert Kochsalzlösung in die Kammer-und Überlauf von der Ausfahrt Port durch eine Saugpumpe mit trap wird entfernt. Die Zubereitung ist im Dunkeln für mindestens 10 min nach links, während lose Zellen und extrazellulären Farbstoff durch Perfusion der Kammer entfernt werden. Temperaturbeständigkeit ist von entscheidender Bedeutung, weil kleine Schwankungen können nicht nur die Ca 2 +-Homöostase, sondern kann auch Auswirkungen auf K d des Farbstoffs. Experimente sind in der Regel bei 25 ° C, erreicht, indem die Temperatur der dunklen Raum auf dieser Ebene. Wir haben festgestellt, dass die Aufrechterhaltung Raumtemperatur auf dem erforderlichen Niveau bietet größere Temperatur und Konzentration Stabilität als mit einer Temperatur gesteuert Bühne oder eine thermostatisch gesteuerte Heizung auf der Saline Zufluss. </li><li> Die Zellen werden unter Phasenkontrast (40x oder 60x Öl-Immersion) Ziel und einen Bereich für die Bildgebung gewählt wird angezeigt. Der Anteil der Poly-D-Lysin beschichtete Fläche, die in der Nähe der Einlassöffnung ist bevorzugt, wobei Kochsalzlösung Strömung laminar und konsequent. Es ist auch wichtig, um ein Gebiet, wo Zelldichte angemessene Verwendung (zu hohe Dichte wirkt sich auf die Qualität und Integrität der Daten durch Abholung des Signals von benachbarten Zellen) und in denen Zellen ausreichend befestigt, sondern Flagellen Aktivität erkennbar ist. Ein Phasenkontrast-Bild wird gespeichert. Und Belichtungszeit auf das erforderliche Minimum, um eine klare Fluoreszenzbild (in der Regel 50-200 ms) zu erhalten reduziert wird; Das Mikroskop wird dann zur Fluoreszenz-Modus (Emission 540 nm Anregung 480 nm) eingeschaltet. </li><li> Das Experiment wird durch die Aktivierung der Zeitreihen-Bildaufnahme-Software (IQ) gestartet. Typischerweise Bilder bei 0,1 Hz erfasst und Beleuchtung ist es, die Zeit der Bildaufnahme nur eingeschränkt mit Hilfe eines Software gesteuertem Verschluss. Viel größer Bildaufnahmeraten kann verwendet werden, aber Zulage muss für Probleme der Bleiche und der Erzeugung von Artefakten durch Foto-Schäden an den Zellen (siehe Diskussion) vorgenommen werden. IQ (und die meisten anderen Akquisition Software-Plattformen) werden in Echtzeit grafische Darstellung der Fluoreszenz während des Experiments zu ermöglichen. </li><li> Nach einer Kontrolle Zeitraum von 3-5 Minuten Dauer Manipulation von Kochsalzlösung Bestandteile (z. B. [Ca 2 +] o) und Applikation von Medikamenten wird durch Ersatz von Kochsalz in der Perfusion Header erreicht. Zeitpunkt der Zugabe der einzelnen Stimulus wird darauf hingewiesen, so dass die Zeit der Ankunft in der Imaging-Kammer berechnet werden kann, eine ausreichende Genauigkeit für die Beurteilung der langsamen Reaktionen hier beschriebene (abgetastet bei 0,1 Hz). Für weitere schnelle Reaktionen eine höhere Genauigkeit kann durch Zugabe von Stimuli direkt an der Saline durch eine zweite Einströmöffnung wie in der Warner RC20 Kammer vorgesehen erreicht werden. </li><li> Die Bilder werden analysiert offline mit IQ. Regions of Interest (ROI) sind rund jeder Zelle (oder einen Teil der Zelle) gezogen und auch eine Zelle frei ist angewählt (für die automatische Subtraktion des Hintergrundes durch die Software. Die Bildserie wird dann überprüft werden, um Zellen, die starben oder unterzog Akrosomreaktion zu entfernen ( die erscheint als eine starke und rasche Zunahme der Fluoreszenz durch den Verlust der zytoplasmatischen Farbstoff) während des Experiments und diejenigen, die ausreichende Bewegung, um Artefakte zu verursachen, wenn sie als Zeitreihen analysiert zeigte gefolgt. </li><li> Eine Zeit-Fluoreszenzintensität Serie wird dann für jede ROI erzielt und diese Daten werden in Excel analysiert offline. Zunächst Fluoreszenz wird auf den Mittelwert während der Kontrollperiode erhalten normalisiert, mit der Gleichung R = [(FF rest) / F Rest] x 100%, wobei R% Veränderung der Fluoreszenz ist im Vergleich zur Kontrollgruppe Zeit, F ist Fluoreszenzintensität zu einem Zeitpunkt t und F Rest ist der Mittelwert von mindestens 30 Bestimmungen des F während der Kontrollperiode erhalten. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1 zeigt eine Serie von Bildern aus einem Experiment, in dem die Zellen mit 3 uM Progesteron stimuliert wurden. Die obere Zeile und Film 1 zeigen die Fluoreszenz-Bildern in Graustufen-und derselben Magier sind unten (und in Film 2) in Falschfarben dargestellt (Lookup-Tabelle &#39;16_colors &quot;in Image J), ​​wo &#39;cool&#39; Farben niedrige Fluoreszenzintensität zeigen und &#39;warm&#39; Farben zeigen hohe Fluoreszenzintensität. Die Zellen können in Falschfarben während des Experiments betrachtet werden, mit Lookup-Tabellen in IQ, sondern mit Graustufen ist in der Regel aussagekräftiger für die Bewertung. Ob die Zellen gut beschriftet sind. Die ersten beiden Bilder wurden bei 0 s und 100 s nach Beginn der Aufzeichnung gesammelt. Fluoreszenz sollte stabil und neigt dazu, am stärksten in der post akrosomalen Bereich und Spermien Hals. Progesteron in die Bildgebung Kammer bei ca. 175 s und die 3. und 4. Bilder (180 s und 220 s) zeigt einen raschen Anstieg der [Ca 2 +] i (Fluoreszenz) mit Ursprung in den hinteren Kopf-und Halsregion der Zelle. Nachfolgende Bilder sind bei 290, 360, 740, 990 und 1440 s, zeigt den Verfall der ursprünglichen [Ca 2 +] i transient und Entwicklung einer sekundären anhaltende Erhöhung. Abbildung 2 zeigt eine Tabellenkalkulation, Umwandlung von Roh-Fluoreszenz-Werte für jede ROI zu normalisierten Fluoreszenz (% Veränderung der Fluoreszenz im Vergleich zur Kontrollgruppe Periode) Abbildung 3 zeigt die Zeit-normalisierte Fluoreszenz Parzellen für 3 Zellen zeigen &quot;typische&quot; Reaktionen auf 3 uM Progesteron. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Beispiel Daten aus einer Zelle mit Progesteron stimuliert. Eine Reihe von Fluoreszenz-Bildern in Graustufen (obere Reihe) und Falschfarbendarstellung (untere Reihe) gezeigt werden. Zeitpunkten 0, 180, 220, 290, 360 und 990er. 3 uM Progesteron in die Bildgebung Kammer bei 175 s. ROIs sind in der ersten Tafel dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Analyse der einzelnen Zelle Fluoreszenz-Daten in Excel. Die Zahlen in schwarz sind Zeitreihen von Fluoreszenz-Daten, vertikal angeordnet. Die Zahlen in rot (unten) sind normalisierten Daten unter Verwendung der Gleichung im Text angegeben. Graph zeigt normalisierte Fluoreszenz-Zeit-Diagramm für die Zelle 64 in diesem Experiment, das nach Stimulation zeigt einen vorübergehenden Anstieg der Fluoreszenz, die durch einen langsamen Anstieg und eine Reihe von kleinen Schwingungen folgen. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Fluoreszenz-time Spuren für 3 einzelne Zellen, wie Veränderung in% in Bezug auf Wert-Regelung zum Ausdruck gebracht .. 3 uM Progesteron war zu der Zeit durch den Pfeil markiert aufgenommen. Eine gestrichelte Linie zeigt die mittlere Kontrolle Fluoreszenz.

<ol>
	<li>Haughland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , (2002).</li><li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging.">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li></ol>

Als erfolgreich durchgeführt, ermöglicht diese Technik die Aufnahme des Vertriebs und der Kinetik der spontanen und induzierten Ca 2 +-Signale in menschlichen Spermien. Die Antworten können aus einer großen Anzahl von Zellen (bis 200), die wichtig ist, da menschliche Spermien können eine Menge von Variationen in ihre spontane und stimulierte Ca 2 +-Signale zeigen, gewonnen werden. Erfolgreiche Kennzeichnung und Überleben der Zellen während der Aufnahme sind hochgradig abhängig von Sample-Qualität. Schlechte Beispiele gibt schlechte Kennzeichnung, schlechte Antworten und Zellen können während der Aufnahme sterben. Menschliche Spermien sind sehr empfindlich auf Foto-Schäden und wir daher den minimal erforderlichen Beleuchtung (sowohl Intensität und Belichtungszeit), um das Überleben der Zelle zu maximieren und minimieren Artefakte durch Zelltod. Eine hochempfindliche Kamera (erlaubt Einsatz von Low-Intensity-Beleuchtung) ist ein großer Vorteil, da die Kamera holt schwache Fluoreszenz. Back-beleuchteten, sind EM-CCD-Kameras besonders gut geeignet, wenn auch sehr teuer. LED-Beleuchtung (anstelle der Verwendung einer Xenon-oder Quecksilber-Lampe mit Anregungsfilter verbessert auch das Überleben der Zelle (Nishigaki et al, 2006). Wir verwenden keine Fura-2, trotz der offensichtlichen Vorteile von ratio-metrischen Bildgebung, da Fura erfordert Anregung mit UV-Licht und weil es notwendig, zwei Bilder für jedes Verhältnis zu nehmen. Für Daten mit einer Wellenlänge, sichtbares Licht Farbstoffe, die Normalisierung der Fluoreszenz-Intensität weitgehend kompensiert Unterschied in der Farbstoff-Laden zwischen den Zellen, nicht aber für Farbverteilung innerhalb einer einzelnen Zelle, und dies muss berücksichtigt werden, erhalten. Obwohl einzelne Wellenlänge Farbstoffe können im Prinzip kalibriert werden, ist die Genauigkeit des Verfahrens Armen und wir versuchen nicht, dies zu tun. Während das Verhältnis von Daten mit Fura-2 (oder die Emission Verhältnis Farbstoff Indo) erhalten, auch ohne Kalibrierung, geben einen akzeptablen getreue Darstellung der relativen Veränderungen in [Ca 2 +] i, ist die Fluoreszenz-Intensität der einzelnen Wellenlängen Farbstoffe weit von linear bezogen auf [Ca 2 +] i. In den nützlichsten Teil der Sättigungskurve die Beziehung zur einzigen Wellenlänge Farbstoffe in der Regel nähert sich logarithmisch. Wir verwenden derzeit Oregon Green BAPTA-1 (Abbildung 4), weil sie empfindlich auf kleine Änderungen in ist [Ca 2 +] i in der Nähe von Ruhepegel s (50-100 nM). Wenn [Ca 2 +] i steigt über 1 uM Reaktionen werden in Bezug auf die Fluoreszenz-Änderung und der Farbstoff unterrepräsentiert kann zu sättigen. Eine Option für die Verbesserung der Technik, ohne auf UV-Anregung ist Wägezellen mit einem Farbstoff wie Fluo-3 und Fura roten Doppeldecker. Beides kann bei 488 nm angeregt werden, aber gleichzeitig ihre Reaktionen sind sehr unterschiedlich. Aufzeichnung der Emission bei 540 und 650 nm liefert ein Verhältnis, das eine bessere Methode für die genaue Überwachung der liefern kann [Ca 2 +] i (Haughland, 2002) und kann für Spermien (Nisigaki et al, 2006). <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Beziehung zwischen freien [Ca 2 +] (nM) und Fluoreszenz-Emission bei Peakwellenlänge (ca. 525 nm) für Oregon Green BAPTA-1 und Oregon Green BAPTA-2. OGB1 ergibt eine höhere Fluoreszenz bei ruhenden [Ca 2 +], sondern sättigt auf den unteren Ebenen und hat somit eine geringere nutzbare Bandbreite. Die Daten für diese Grundstücke wurden von der Molecular Probes Handbuch (Haughland, 2002) erhalten.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Low light level Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QImaging</td>
<td>Rolera XR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oregon Green BAPTA-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>06807</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>IQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Institues of Health</td>
<td>Image J</td>
<td>Public domain software</td>
</tr>
<tr>
<td>LED illumination system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cairn Research</td>
<td>Opto LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

techniques for imaging ca2+ signaling in human sperm

Fluoreszenz-Mikroskopie von Zellen mit fluoreszierenden, Ca geladen<sup&gt; 2 +</sup&gt; Farbstoffe für die Messung von räumlichen und zeitlichen Aspekte der Ca verwendet<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signalisierung in lebenden Zellen. Hier beschreiben wir die Methode in unseren Labors verwendet zum Laden Suspensionen von menschlichen Spermien mit Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Berichterstattung Farbstoffe und Messung der Fluoreszenz-Signal während der physiologischen Stimulation. Bewegliche Zellen werden durch direkte Swim-up isoliert und inkubiert unter capacitating Bedingungen für 0-24 h, je nach dem Experiment. Die Zell-Permeationsmittel AM (Acetoxy-Methylester) ester Form des Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Berichterstattung Farbstoff wird dann in eine Zelle Aliquot und einen Zeitraum von 1 h zum Laden des Farbstoffes in das Zytoplasma darf hinzugefügt. Wir verwenden sichtbaren Wellenlängenbereich Farbstoffe Foto-Schäden an den Zellen gering zu halten, aber dies bedeutet, dass ratiometrische Aufnahme nicht möglich ist. Vor-und Nachteile dieses Ansatzes werden diskutiert. Während der Ladezeit Zellen werden in einem bildgebenden Kammer eingeführt und lässt auf ein Poly-D-Lysin beschichteten Deckglas haften. Am Ende der Ladezeit überschüssiger Farbstoff und lose Zellen werden durch Verbindung der Kammer an die Perfusionsapparatur entfernt. Die Kammer wird kontinuierlich perfundierten, sind Reize und modifiziert Salinen dann auf die Perfusion-Header hinzugefügt. Die Experimente werden durch Zeitraffer-Übernahme von Fluoreszenz-Bildern erfasst und analysiert im Detail offline, durch manuelles Zeichnen regions of interest. Die Daten werden vor Stimulus Ebenen, so dass für jede Zelle (oder ein Teil einer Zelle), eine Grafik der Ca zeigt normalisierte<sup&gt; 2 +</sup&gt; Antwort in% Veränderung der Fluoreszenz erreicht ist.

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Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evozierte [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] I-Signale der einzelnen menschlichen Spermien beurteilt. Bewegliche Zellen mit Ca geladen<sup&gt; 2 +</sup&gt; Fluoreszenzfarbstoff (AM-Ester-Methode) und immobilisiert in einem perfundierbaren Kammer. Die Zellen werden durch Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie abgebildet und stimuliert über die Perfusion Medium. Responses von einzelnen Zellen (oder Regionen) sind offline analysiert mit Hilfe von Excel.

Techniques for Imaging Ca 2 + Signaling in menschlichen Spermien

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

techniques-for-imaging-ca2-signaling-in-human-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

17.0K Aufrufe.  University of Birmingham. Stimulus-evozierte [Ca 2 +] I-Signale der einzelnen menschlichen Spermien beurteilt. Bewegliche Zellen mit Ca geladen 2 + Fluoreszenzfarbstoff (AM-Ester-Methode) und immobilisiert in einem perfundierbaren Kammer. Die Zellen werden durch Zeitraffer-Fluoreszenzmikroskopie abgebildet und stimuliert über die Perfusion Medium. Responses von einzelnen Zellen (oder Regionen) sind offline analysiert mit Hilfe von Excel.

Serie: Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

In vivo Ca 2 + - Imaging von Pilzkörper Neuronen während olfaktorischen Lernen in der Honigbiene

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Forschung

Biologie

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluoreszenz In situ Hybridisierung (FISH)-Protokoll in menschlichen Spermien

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch-Clamp-und Perfusion Techniken zur Untersuchung von Ionenkanälen ausgedrückt in Xenopus Oozyten

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Visualization of Vascular Ca 2 + Signaling Ausgelöst durch Parakrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

Ein High-Content-Imaging Workflow Grb2 Signaling-Komplexe durch Expression Cloning Studie

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

Isolierung humaner Vorhofmyozyten für gleichzeitige Messungen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transienten und Membrane Currents

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Mess-intrazellulären Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Änderungen in menschlichen Spermien mit vier Techniken: Konventionelle Fluorometrie, Stopped Flußfluorometrie, Durchflusszytometrie und Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imaging Lokale Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Signale in kultivierten Säugetierzellen

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Techniques for Imaging Prometaphase und Metaphase der Meiose I in fester<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...