Unser Forschungsprogramm konzentriert sich darauf, zu verstehen, wie verschiedene Formen des Zelltods reguliert werden. Generell untersuchen wir den Zelltod im Rahmen von Krebstherapien mit dem Ziel zu lernen, wie Medikamente den Zelltod stoppen und wie man diese Reaktionen besser und spezifischer gestalten kann. Es wird immer deutlicher, dass es viele verschiedene Arten des regulierten Zelltods gibt.
Das Feld hat derzeit mindestens 14 mechanistisch unterschiedliche Todesarten identifiziert. Die meisten von ihnen führen zu einem morphologisch nekrotischen Tod, und im Allgemeinen wissen wir sehr wenig darüber, wie diese Signalwege funktionieren. Ein wirksamer Weg, um die Regulation des Zelltods zu untersuchen, ist die Verwendung der funktionellen Genomik.
Mit anderen Worten, jedes Gen systematisch zu stören und zu bestimmen, wie sich diese Störungen auf den Zelltod auswirken. Wenn dies im Zusammenhang mit Medikamenten durchgeführt wird, wird dies als chemogenetisches Profiling bezeichnet. Chemogenetische Screenings untersuchen in der Regel, wie sich Gen-Knockouts auf die endgültige Populationsgröße auswirken.
Die Populationsgröße kann jedoch durch Veränderungen der Wachstumsrate, der Sterberate oder beidem beeinflusst werden. Derzeitige Screening-Methoden sind nicht in der Lage, todregulatorische Gene zu identifizieren, da die Variation der Wachstumsrate einschränkende Auswirkungen hat. Medusa verwendet Simulationen des Ansprechens auf Medikamente, um zu modellieren, wie sich die Veränderung der Wachstumsrate oder der Sterberate auf die endgültige Populationsgröße auswirkt.
Diese Simulationen ermöglichen es uns, die medikamenteninduzierte Sterblichkeitsrate für jedes Gen im Screening zu extrahieren und andere Störfaktoren zu entfernen. Zunächst werden Zellen in schwarzen 96-Well-Platten mit klarem Boden bei einer Aussaatdichte zwischen 1500 und 5.000 Zellen pro Well plattiert. Inkubieren Sie die Platten bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid und Feuchtigkeit für 16 bis 24 Stunden. Bereiten Sie die Wirkstoffverdünnung in Medien vor, die die zuvor optimierte Cytotox-Konzentration enthalten.
Lycieren Sie eine Platte mit Triton X in der optimierten Konzentration. Legen Sie dann die Platte in den Plattenreader und messen Sie die Cytotoxfluoreszenz in den Experimentierplatten bei T0 mit den optimierten Einstellungen und dann zu einem geeigneten späteren Zeitpunkt. Nach dem letzten Zeitpunkt werden die experimentellen Platten mit Triton X analysiert, um die endgültige Populationsgröße jeder Bedingung zu bestimmen.
Berechnen Sie die fraktionale Lebensfähigkeit anhand der Endpunktdaten und passen Sie die Ergebnisse an Dosis-Wirkungs-Kurven an. Bewerten Sie die Dosis-Wirkungs-Kurven, um Arzneimitteldosen zu identifizieren, die einen Zelltod von etwa 50 % induzieren. Nach der Optimierung der Wirkstoffdosis, um den Zelltod zu induzieren, weisen Sie Nicht-Ziel-SG-RNAs nach dem Zufallsprinzip Nicht-Zielgenen zu.
Trimmen Sie SG-RNAs mit niedrigen Zählungen basierend auf einer gewählten Cutoff-Strategie. Simulieren Sie alle möglichen Störungen der Nettopopulationswachstumsrate (NPG), indem Sie eine for-Schleife verwenden, um einen Bereich von NPG-Werten auszuwerten. Gleichen Sie für jede experimentelle einzelne SG-RNA die simulierte Faltungsänderung ab, die den beobachteten Daten am nächsten kommt, und ordnen Sie der SG-RNA die entsprechende relative Wachstumsrate zu.
Bestimmen Sie dann die medikamenteninduzierte Wachstumsrate vor dem Tod anhand von Lebendzellzähldaten. Passen Sie die Daten an eine einfache Exponentialgleichung an, um die Wachstumsrate abzuleiten. Berechnen Sie die medikamenteninduzierte Wachstumsrate nach dem Einsetzen des Todes, indem Sie die Daten zur Lebendzellzählung und die Werte für die Wirkstoffqualität kombinieren.
Plotten Sie die Note für die ausgewählte Arzneimitteldosis in einem Graddiagramm auf. Unter Verwendung der experimentell ermittelten Koordination zwischen drogeninduziertem Wachstum und Sterberate erstellen Sie ein Modell, um die drogeninduzierte Populationsgröße im Zeitverlauf zu simulieren. Entwickeln Sie dann ein Medusa-Modell, das NPG, medikamenteninduzierte Wachstumsraten vor und nach dem Einsetzen des Todes in Verdopplungen pro Stunde und die medikamenteninduzierte Sterberate umfasst.
Legen Sie den Startzeitpunkt auf null Stunden fest und definieren Sie Endzeitpunkte sowohl für unbehandelte als auch für behandelte Erkrankungen. Simulieren Sie alle möglichen Störungen der Wachstums- und Sterberaten für das Basismodell. Berechnen Sie für jede Kombination die Logarithmusbasis zwei der am Assay-Endpunkt beobachteten Faltenänderung.
Triangulieren Sie für jede SG-RNA die medikamenteninduzierte Sterberate, die die beobachtete Faltungsänderung hervorrufen würde. Beginnen Sie mit der Extraktion der vorgegebenen relativen Wachstumsrate. Bestimmen Sie die Raten für arzneimittelinduziertes Wachstum vor und nach dem Einsetzen des Todes.
Wenden Sie die relative Wachstumsrate aus dem NPG an, um die proportionalen Wachstumsraten für arzneimittelinduzierte Wachstumsraten vor und nach dem Eintritt des Todes zu berechnen. Unter Verwendung der Einschränkungen für NPG, medikamenteninduzierte Wachstumsrate vor und nach dem Einsetzen des Todes, identifizieren Sie die simulierte Faltenänderung, die der beobachteten Faltenänderung für jede SG-RNA am nächsten kommt. Bestimmen Sie die Wachstums- und Sterberaten auf Genebene für jedes Gen in der Bibliothek.
Berechnen Sie die mittleren Wachstums- und Sterberaten für alle SG-RNAs, die mit jedem Gen assoziiert sind, typischerweise zwischen 4 und 10 SG-RNAs. Um empirische P-Werte zu berechnen, bootstrappen Sie die Daten auf SG-RNA-Ebene und wenden Sie eine Korrektur der Falschentdeckungsrate mit dem Benjamin-Hochberg-Verfahren an. Die fraktionierte Lebensfähigkeit von U2-OS-Zellen nahm dosisabhängig ab, wobei eine Letalität von etwa 50 % bei fünf mikromolaren Etoposiden nach 96 Stunden beobachtet wurde.
Die Größe der genesenen Population nahm nach viertägiger Exposition gegenüber fünf mikromolaren Etoposiden um 40 % bis 50 % ab, was den Zelltod während der medikamentösen Behandlung bestätigt. Die Gradanalyse prognostizierte, dass fünf mikromolare Etoposid eine signifikante Verringerung der Wachstumsrate verursachten, wobei der Zelltod erst nach vollständigem Wachstumsstillstand einsetzte. Die Medusa-Analyse zeigte, dass XRCC fünf Knockout-Zellen unter unbehandelten Erkrankungen ein langsames Wachstum und hohe medikamenteninduzierte Todesraten unter Etoposidbehandlung zeigten.
Validierungsexperimente bestätigten, dass XRCC 5-Knockout-Zellen unter unbehandelten Bedingungen ein langsameres Wachstum und unter Etoposid erhöhte Sterblichkeitsraten aufwiesen, was mit den Vorhersagen von Medusa übereinstimmt.
