No invasiva imágenes ópticas de la vasculatura linfática de un ratón

Holly A. Robinson; SunKuk Kwon; Mary A. Hall; John C. Rasmussen; Melissa B. Aldrich; Eva M. Sevick-Muraca

doi:10.3791/4326

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Resumen

Recientemente desarrollados utilizando técnicas de imagen de fluorescencia en el infrarrojo cercano (NIRF) puede ayudar a dilucidar el papel del sistema linfático juega en la metástasis del cáncer, la respuesta inmune, la reparación de heridas, y otras enfermedades asociadas linfático.

Resumen

El sistema linfático vascular es un componente importante del sistema circulatorio que mantiene la homeostasis de fluidos, proporciona la vigilancia inmune, y media la absorción de grasas en el intestino. Sin embargo, a pesar de su función crítica, existe una comprensión relativamente poco de cómo funciona el sistema linfático se adapta a servir a estas funciones en la salud y la enfermedad ^1. Recientemente, hemos demostrado la capacidad de la arquitectura dinámicamente imagen linfático y los ganglios "bombeo" acción en sujetos humanos normales, así como en las personas que padecen disfunción linfática mediante la administración de un rastro en el infrarrojo cercano fluorescente (NIRF) colorante y una costumbre, Gen III- intensificado sistema de imágenes ^2-4. NIRF imágenes mostraron cambios dramáticos en la arquitectura linfático y la función con la enfermedad humana. Aún no está claro cómo se producen estos cambios y nuevos modelos animales se están desarrollando para dilucidar su base genética y molecular. En este protocolo, se presenta linfático NIRF, salameda animal de formación de imágenes utilizando ^5,6 verde de indocianina (ICG), un colorante que se ha utilizado durante 50 años en los seres humanos ^7, y un NIRF marcada con colorante cíclico dominio de unión de albúmina (CABD-IRDye800) péptido que se une preferentemente a la albúmina humana y de ratón ⁸ . Aproximadamente 5,5 veces más brillante que ICG, Abd-IRDye800 tiene un perfil linfático autorización similar y se puede inyectar en dosis más pequeñas de ICG para lograr suficientes señales NIRF para formación de imágenes ^8. Debido a que ambos se unen CABD-IRDye800 ICG a la albúmina y en el espacio intersticial ^8, ambas pueden representar el transporte de proteínas en activo y dentro de los vasos linfáticos. Intradérmica (ID) inyecciones (l 5-50) de ICG (645 mM) o CABD-IRDye800 (200 mM) en solución salina y se administra a la cara dorsal de cada pata trasera y / o el lado izquierdo y derecho de la base de la cola de un ratón isoflurano anestesia. La concentración de colorante resultante en el animal es 83-1,250 mg / kg de ICG o 113-1,700 mg / kg paraCABD-IRDye800. Inmediatamente después de las inyecciones, las imágenes linfático funcional se lleva a cabo durante un máximo de 1 h usando un personalizado, un animal pequeño NIRF sistema de formación de imágenes. Resolución espacial Whole animales pueden representar los vasos linfáticos fluorescentes de 100 micrones o menos, y las imágenes de las estructuras de hasta 3 cm de profundidad pueden ser adquiridos ^9. Las imágenes se adquieren mediante V + software + y analizados mediante el software ImageJ o MATLAB. Durante el análisis, regiones consecutivas de interés (ROIs) que abarca todo el diámetro del recipiente se dibujan a lo largo de un vaso linfático dado. Las dimensiones de cada retorno de la inversión se mantienen constantes para un buque determinado y la intensidad NIRF se mide para cada ROI para evaluar cuantitativamente "paquetes" de linfa en movimiento a través de los vasos.

Protocolo

Todos los estudios con animales se realizaron de conformidad con las normas de la Universidad de Texas Health Science Center (Houston, TX), Departamento de Medicina Comparada, y el Centro de Imagen Molecular después de la revisión y aprobación del protocolo por el cuidado de su respectivo Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) o Animal Welfare Committee (AWC).

1. Preparación de los animales 24 horas antes de la Radiología

Los siguientes pasos se debe hacer (si es necesario) el día antes de exponer linfático lleva a cabo.

Lugar animal en una caja de inducción con isoflurano y sosegado.
Una vez que el animal se encuentra en un estado de anestesia profunda (monitorizado con la maniobra de dedo del pie-pinch), animal sedado lugar en un cojín de pañal / pelusa y la nariz posición en un cono nasal conectada a gas isoflurano.
Clip todo el pelo / piel (si los hay) alrededor de la zona a explorar.
Aplicar agente depilatorio (Nair) a la zona rasurada y se deja on de la piel para un máximo de 3 minutos.
Suavemente limpie todo agente depilatorio con una gasa húmeda y caliente o una toalla de papel.
Lave suavemente la piel con agua tibia y seque suavemente el área con una gasa o toalla de papel.
Deje que los animales puedan recuperarse en una almohadilla eléctrica o bajo una lámpara de calor, y volver a su jaula.

2. Día de Imágenes

Agente de formación de imágenes reconstituir con agua estéril, luego se diluye con estéril, normal (0,85%) de solución salina para alcanzar 645 mM (5 g/10 l) durante ICG o 200 mM (6,8 g/10 l) durante CABD-IRDye800. Mantener las soluciones en la oscuridad condiciones y uso dentro de las 6 horas de la reconstitución.
Lugar animal en una caja de inducción con isoflurano y sosegado.
Una vez que el animal se encuentra en un estado de anestesia profunda (controlado con la maniobra de punta-pinch), animal sedado lugar de costado sobre una plataforma de pañales / pelusa y la nariz posición en un cono de nariz conectada a gas isoflurano.
Apague las luces (por lo que la habitación esoscuro). Si es necesario, una luz de escritorio halógeno pequeña se puede utilizar para una pequeña cantidad de luz para ver inyecciones.
Usando una jeringa de insulina con una aguja de calibre 31-, inyectar ID 5 l a 50 l de ICG o CABD IRDye800-en la cara dorsal de cada pata trasera y / o en el lado izquierdo y derecho de la base de la cola, dependiendo el área de interés (véase la discusión). Cada dosis inyectada puede variar desde 0,083 hasta 1,25 mg / kg (ICG) o 0.113 a 1.7 mg / kg (CABD-IRDye800). Los volúmenes de inyección puede variar con la cepa animal y sitio de la inyección. Para los ratones atímicos, el volumen de inyección puede ser de 5 l (pata trasera) o 10 l (base de la cola). Si el animal no está en el sistema de formación de imágenes para la inyección (s), colocar al animal en el sistema de imágenes inmediatamente después de la inyección (s).
Si no se observa absorción de colorante en los vasos linfáticos, paso 2,5 tendrá que repetirse según sea necesario de acuerdo al protocolo de animales.
Una vez que se observan vasos linfáticos, cubra el sitio de la inyección con cinta eléctrico negro o negro paper.
Adquirir imágenes linfáticos de hasta 1 hora con V + software + y un animal pequeño, NIRF sistema de imágenes. (Los animales son sedados con isoflurano y las respiraciones se supervisan mientras que las imágenes están adquiriendo.) Mientras animal pequeño, generadores de imágenes NIRF están comercialmente disponibles, utilizamos un servicio personalizado, pequeños animales NIRF sistema de imagen que consiste en un diodo láser 785-nm (1005-9mm-78503 , intenso, North Brunswick, NJ) equipado con una lente asférica (C24TME-B, Thorlabs, Newton, NJ), difusor (ED1-C20, Thorlabs) y filtro (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ) para crear un campo de excitación uniforme que ilumina el animal en una tasa de fluencia incidente de menos de 1,4 mW por centímetro cuadrado ^10. Un electrón multiplicando dispositivo de carga acoplada (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Trenton, NJ) sistema de cámara con dos 830-nm filtros (AND11333, Andover Corp., Salem, NH) y una lente de 28-mm Nikkor (1992, Nikon, Melville, NY) se utiliza para capturar imágenes linfáticos con integración times de 200 ms para imágenes dinámicas y estáticas ms 800 para imágenes ^5. Véase la figura 1 para la configuración del sistema, la tabla para obtener más detalles de cada componente, y el debate para una breve discusión de las propiedades imager clave.
Deje que los animales puedan recuperarse en una almohadilla eléctrica o bajo una lámpara de calor y volver a su jaula, o la eutanasia.
Analizar imágenes utilizando ImageJ o software MATLAB. Véase la Figura 6.