JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Yakın kızılötesi floresans (NIRF) kullanarak en son geliştirilen görüntüleme teknikleri lenfatik sistem kanseri metastazı oynadığı rol, immün yanıt, yara onarımı ve diğer lenfatik ilişkili hastalıkların ortaya çıkmasına yardımcı olabilir.

Özet

Lenfatik damar sistemi, sıvı dengesinin korur bağırsaktaki immün gözetim ve aracılık yağ emilimini sağlar dolaşım sisteminin önemli bir bileşenidir. Oysa eleştirel fonksiyonuna rağmen, lenfatik sistem sağlığı ve hastalıkları 1 bu işlevlere hizmet adapte nasıl nispeten biraz anlayış vardır. Son zamanlarda, Gen III-, dinamik görüntü lenfatik mimarisi ve lenf gibi iz yakın kızılötesi floresan (NIRF) boya yönetim ve özel kullanarak lenfatik disfonksiyon muzdarip kişilerin yanı sıra normal insan deneklerde "pompalama" işlemi yeteneğini göstermiştir görüntüleme sistemi 2-4 yoğunlaştı. NIRF görüntüleme insan hastalıkları ile lenfatik mimarisi ve işlevi dramatik değişiklikler gösterdi. Bu değişikliklerin ortaya çıkar ve yeni hayvan modelleri kendi genetik ve moleküler temelini gün ışığına geliştirilmektedir nasıl belirsizliğini koruyor. Bu protokol, biz NIRF lenfatik, s sunmakalışveriş hayvan görüntüleme 5,6 green (ICG), insanlarda 7. 50 yıldır kullanılan bir boya ve tercihen fare ve insan albumin 8 bağlayan NIRF boya etiketli siklik albümin bağlanma alanı (cABD-IRDye800) peptid indosiyanin kullanarak . ICG göre yaklaşık 5.5 kat daha parlak, cABD-IRDye800 benzer bir lenfatik açıklık bir profile sahiptir ve görüntüleme 8 için yeterli NIRF sinyal elde etmek için ICG'den daha küçük dozlar halinde enjekte edilebilir. Interstisyel boşluk 8 albümin hem cABD-IRDye800 ve ICG bağlama, her ikisi de içine ve lenfatikler içerisinde aktif bir protein taşıma tasvir edebilir çünkü. İntradermal (ID) ICG enjeksiyonu (5-50 ul) (645 uM) ya da tuzlu su içinde cABD-IRDye800 (200 uM), her bir arka ayak ve / veya tabanının sol ve sağ taraf dorsal ile uygulanırlar Bir izofluran-anestezi fare kuyruğu. Hayvanda çıkan boya konsantrasyonu 83-1,250 ug / kg veya ICG için 113-1,700 mg / kg 'dır içincABD-IRDye800. Hemen enjeksiyonları takiben, fonksiyonel lenfatik görüntüleme özelleştirilmiş, küçük hayvan NIRF görüntüleme sistemi kullanılarak en fazla 1 saat için yapılır. Tüm hayvan uzamsal çözünürlük derinliği 3 cm 9 elde edilebilir yapıların floresan lenfatik 100 mikron veya daha az olan gemiler ve görüntüleri tasvir edebilir. Görüntüleri V + + yazılımı kullanılarak kazanılmış ve ImageJ veya MATLAB yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. Analiz sırasında, tüm damar çapı kapsayan faiz (ROI) ardışık bölgeler belirli bir lenf damar boyunca çizilir. Her bir ROI için ölçüler kantitatif lenf damarları yoluyla hareket "paketleri" değerlendirmek için her bir ROI için ölçülür verilen damar ve NIRF yoğunluğu için sabit tutulur.

Protokol

Bütün hayvan çalışmaları Texas Sağlık Bilimleri Merkezi (Houston, Teksas), Karşılaştırmalı Tıp Anabilim Dalı, inceleme ve kendi Kurumsal Hayvan Bakım tarafından protokol onayından sonra Moleküler Görüntüleme Merkezi Üniversitesi standartlarına uygun olarak gerçekleştirilen ve Kullanım Kurulu yapıldı (IACUC) veya Hayvan Refahı Komitesi (AWC).

1. Görüntüleme öncesinde 24 Hr Hayvanlar hazırlanması

Lenfatik görüntüleme gerçekleşmeden önce aşağıdaki adımları gün (gerektiği gibi) yapılmalıdır.

  1. Sıra bir indüksiyon kutusuna hayvan ve izofluran ile oturaklı.
  2. Hayvan derin anestezi (TEP-tutam manevrası ile izlenmektedir), izofluran gaza bağlı bir burun konisi bir bezi / kabartmak pad ve pozisyon burun üzerinde yer sedasyon hayvan bir devlet olduğunu bir kez.
  3. Görüntülenecek alanı çevresinde tüm saç / kürk (varsa) klipsleyin.
  4. Kırpılan alana tüy dökücü ajan (Nair) yağlayın ve o bırakınn 3 dakikaya kadar için cilt.
  5. Yavaşça sıcak, nemli gazlı bez veya kağıt havlu ile tüm dökücü ajan siliniz.
  6. Nazikçe ılık su ile cildi yıkayın ve yavaşça gazlı bez veya kağıt havlu ile kurulayın.
  7. Hayvanlar bir ısıtma yastığı veya bir ısı lambası altında kurtarmak ve kendi kafesine geri dönmek için izin ver.

2. Görüntüleme Günü

  1. Steril su ile sulandırın görüntüleme ajanı, ardından cABD-IRDye800 için ICG veya 200 uM (6.8 μg/10 ul) için 645 uM (5 μg/10 ul) elde etmek için steril, normal (% 0,85) salin ile seyreltin. Karanlıkta çözümleri tutun koşulları ve sulandırma 6 saat içinde kullanılmak.
  2. Sıra bir indüksiyon kutusuna hayvan ve izofluran ile oturaklı.
  3. Hayvan derin anestezi (TEP-tutam manevrası ile izlenmektedir), izofluran gaza bağlı bir burun konisi bir bezi / kabartmak pad ve pozisyon burun üzerinde yan yeri sedasyon hayvan bir devlet olduğunu bir kez.
  4. (Yani oda ışıkları kapatınkoyu). Gerekirse, küçük bir masa halojen ışık enjeksiyon görmek için ışık küçük bir miktar için de kullanılabilir.
  5. Bir 31 gauge iğne ile bir insülin şırıngası kullanılarak bağlı olarak, her bir arka ayak ve / dorsal olarak ya da kuyruk tabanının sol ve sağ tarafında ICG veya cABD-IRDye800 50 ul ID 5 ul enjekte ilgi alanı (Tartışma bakın). Her bir dozu enjekte 0,083 ila 1,25 mg / kg (ICG) ya da 0,113-1,7 mg / kg (cABD-IRDye800) kadar değişebilir. Enjeksiyon hacmi hayvan zorlanma ve enjeksiyon yeri ile değişecektir. Atimik fareler için, enjeksiyon hacmi 5 ul (arka pençe) veya 10 ul (kuyruk baz) olabilir. Hayvan püskürtme (ler) i için görüntüleme sistemi altında değilse, sonra hemen görüntüleme sistemi altında hayvan yerleştirmek enjeksiyon (ler).
  6. Hiçbir boya alımı lenfatiklerde görülürse hayvan protokol başına gerektiği gibi, adım 2.5 tekrarlanması gerekir.
  7. Bir kez lenfatikler görülen, siyah elektrik bandı veya siyah pa ile enjeksiyon yerinde kapağıbaşına.
  8. Kadar kullanarak 1 saat için lenfatik görüntüleri Edinme V + + yazılım ve küçük bir hayvan, NIRF görüntüleme sistemi. (Hayvanlar izofluran ile uyuşturulmuş edilir ve görüntüler elde edilir sırasında solunum izlenir.) Küçük bir hayvan da, NIRF görüntüleyiciler ticari olarak temin edilebilir, bir 785-nm lazer diod oluşan bir özel, küçük hayvan NIRF görüntüleme sistemi (1005 9mm-78503 kullanmak , Yoğun, Kuzey bir asferik lens (C24TME-B, Thorlabs, Newton, NJ), difüzör (ED1-C20, Thorlabs) ile donatılmış Brunswick, NJ) ve filtre (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ) santimetrekare başına 10 daha az 1,4 mW bir olay fluence oranda hayvan aydınlatan bir üniforma uyarım alan oluşturmak için. Bir elektron, iki 830-nm filtreler (AND11333, Andover Corp, Salem, NH) ve 28 mm Nikkor lens (1992, Nikon, kamera sistemi şarj çiftli aygıt (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Trenton, NJ) çarpılması Melville, NY) entegrasyon tim ile lenfatik görüntü yakalamak için kullanılırstatik görüntüleme 5 için dinamik görüntüleme ve 800 msn için 200 msn es. Sistem yapılandırması, her bileşenin ek ayrıntılar için Tablo ve anahtar görüntüleyici özellikleri kısa bir tartışma için Tartışma için Şekil 1'e bakınız.
  9. Hayvanlar bir ısıtma yastığı veya bir ısı lambası altında kurtarmak ve kendi kafesine geri dönmek, ya da ötenazi için izin ver.
  10. ImageJ veya MATLAB yazılımı kullanarak görüntüleri analiz edin. Şekil 6'ya bakınız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Farelerde NIRF Lenfatik Görüntüleme Örneği

ICG veya cABD-IRDye800 normal bir fare kuyruk dibinde kimlik enjekte, kuyruk dibinde enjeksiyon yeri ve kasık lenf düğümü (LN) arasındaki lenfatik damar hemen görüntülenmiştir olmalıdır. Kısa bir süre sonra, enjeksiyon (birkaç saniye dakika), kasık LN ve koltuk altı LN arasında lenf damarı olarak, Şekil 2'de görüldüğü görselleştirilmiş olmalıdır. Insanlarda olduğu gibi farelerde lenfatik hayvanda...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Biz farelerde etiketli lenf damarlarının görüntüleri yakalamak için özel, küçük hayvan NIRF görüntüleme sistemi kullanın. Lenf dolaşımı filmleri oluşturmak için, 300 veya daha fazla görüntü alınır. Filmlerde lenfatiklerin fonksiyonel analizi için, iki veya daha fazla ROI'ler manuel lenf damarı boyunca çizilir. İB'nin boyutları her bir kap için sabit tutulur ve yaklaşık olarak damar çapı vardır. Bütün hayvanlar uzaysal çözünürlüğü 100 mikron veya daha az olan floresan l...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var, ama bazı yazarlar bir patent listelenir.

Teşekkürler

NIH R01 CA128919 ve NIH R01 HL092923: Bu çalışma Eva Sevick için aşağıdaki bağışları ile desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Çözümler, Reaktifler ve Ekipmanları Şirket Katalog Numarası Yorumlar
İndosiyanin green (ICG) Patheon Italia SPA NDC 25431-424-02 645 uM (5 μg/10 mcL) için sulandırın
Döngüsel Albumin Bağlama Domain (cABD) Bachem Görenek 200 uM (6.8 μg/10 uL) ile sulandırın
IRDye800 Li-COR IRDye 800CW Üreticinin talimatlarına göre sulandırın; equilmolar konsantrasyonlarda cABD konjuge
Steril Su Hospira, Inc, Lake Forest, IL NDC 0409-4887-10
Nair Church & Dwight Co,A.Ş. Yerel Mağazaları www.nairlikeneverbefore.com
Görüntüleme Sistemi (bileşenleri aşağıda) Moleküler Görüntüleme Merkezi N / A Laboratuvarımızda özel olarak üretilmiştir.
Elektron-Çarpma şarj bağlı cihaz (EMCCD) kamera Princeton Instruments, Trenton, NJ Foton Max 512
Nikon fotoğraf makinesi objektifi Nikon Inc, Melville, NY Model No 1992, Nikkor 28mm
Optik filtresi Andover Corp, Salem, NH ANDV11333 İki 830.0/10.0 nm bant geçirici filtre objektif önüne kullanılmıştır
785 nm lazer diyot Yoğun Ltd, North Brunswick, NJ 1005-9MM-78503 Optik çıkış 500 mW
Collimating optikler Thorlabs, Newton, NJ C240TME-B Öncesinde temizleme filtresi Collimates lazer çıkış
Temizlik-up filtre Semrock, Inc, Rochester, NY LD01-785/10-25 Floresans bandında lazer emisyonu kaldırır
Optik difüzör Thorlabs, Newton, NJ ED1-C20 Hayvan üzerinde lazer yayılır
V + + Dijital Optik, Browns Bay, Auckland, Yeni Zelanda Sürüm 5.0 Yazılım kamera sistemi kontrol etmek ve görüntüleri bilgisayara kaydetmek için kullanılır. http://digitaloptics.net/
Aşağıdaki yazılım paketleri iki analitik yazılım görüntü analizi için kullanılabilmektedir
ImageJ Ulusal EnstitüsününSağlık, Bethesda, MD kitapçığın ikinci bölümüne bakın Mevcut en güncel sürümü Az SORULAR mevcuttur http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks, Natick, MA Sürüm 2008a veya üstü http://www.mathworks.com/

Referanslar

  1. Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
  2. Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
  3. Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
  4. Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
  5. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
  6. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
  7. Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
  8. Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. , (2011).
  9. Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
  10. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
  11. Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
  12. Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
  13. Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
  14. Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
  15. Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
  16. Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
  17. Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
  18. Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
  19. Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
  20. Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm nolojiSay 73T pAnatomiFizyolojiMolek ler BiyolojiBiyomedikal M hendisli iKanser BiyolojisiOptik g r nt lemelenfatik g r nt lemefare g r nt lemenon invaziv g r nt lemeyak n k z l tesi floresansdamardola m sistemilenfatik sistemlenfdermisenjeksiyong r nt lemefarehayvan modeli

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır