Неинвазивная оптических изображений из лимфатических сосудов от мыши

В последнее время разработаны методы визуализации использованием ближней инфракрасной флуоресценции (NIRF) может помочь выяснение роли лимфатической системы играет в раковых метастаз, иммунный ответ, заживления ран и других лимфатических-ассоциированных заболеваний.

Аннотация

The lymphatic vascular system is an important component of the circulatory system that maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and mediates fat absorption in the gut. Yet despite its critical function, there is comparatively little understanding of how the lymphatic system adapts to serve these functions in health and disease¹. Recently, we have demonstrated the ability to dynamically image lymphatic architecture and lymph "pumping" action in normal human subjects as well as in persons suffering lymphatic dysfunction using trace administration of a near-infrared fluorescent (NIRF) dye and a custom, Gen III-intensified imaging system^2-4. NIRF imaging showed dramatic changes in lymphatic architecture and function with human disease. It remains unclear how these changes occur and new animal models are being developed to elucidate their genetic and molecular basis. In this protocol, we present NIRF lymphatic, small animal imaging^5,6 using indocyanine green (ICG), a dye that has been used for 50 years in humans⁷, and a NIRF dye-labeled cyclic albumin binding domain (cABD-IRDye800) peptide that preferentially binds mouse and human albumin⁸. Approximately 5.5 times brighter than ICG, cABD-IRDye800 has a similar lymphatic clearance profile and can be injected in smaller doses than ICG to achieve sufficient NIRF signals for imaging⁸. Because both cABD-IRDye800 and ICG bind to albumin in the interstitial space⁸, they both may depict active protein transport into and within the lymphatics. Intradermal (ID) injections (5-50 μl) of ICG (645 μM) or cABD-IRDye800 (200 μM) in saline are administered to the dorsal aspect of each hind paw and/or the left and right side of the base of the tail of an isoflurane-anesthetized mouse. The resulting dye concentration in the animal is 83-1,250 μg/kg for ICG or 113-1,700 μg/kg for cABD-IRDye800. Immediately following injections, functional lymphatic imaging is conducted for up to 1 hr using a customized, small animal NIRF imaging system. Whole animal spatial resolution can depict fluorescent lymphatic vessels of 100 microns or less, and images of structures up to 3 cm in depth can be acquired⁹. Images are acquired using V++ software and analyzed using ImageJ or MATLAB software. During analysis, consecutive regions of interest (ROIs) encompassing the entire vessel diameter are drawn along a given lymph vessel. The dimensions for each ROI are kept constant for a given vessel and NIRF intensity is measured for each ROI to quantitatively assess "packets" of lymph moving through vessels.

протокол

Все исследования на животных были проведены в соответствии со стандартами Техасского университета Научного центра здоровья (Хьюстон, Техас), кафедры сравнительной медицины и Центром молекулярной визуализации после рассмотрения и утверждения протокола их соответствующими Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC) или Animal Welfare комитета (AWC).

1. Подготовка животных 24 грн До изображений

Шаги необходимо сделать (при необходимости) за день до лимфатической изображений происходит.

Место животных в индукционной коробки и степенный изофлураном.
Когда животное находится в состоянии глубокого наркоза (мониторинг с ног щепотку маневра), место седативные животных на пеленки / пух площадки и положение носа в носовой конус связан с изофлуран газа.
Клип все волосы / мех (если таковые имеются) вокруг области, чтобы быть отображена.
Нанесите средство для удаления волос агент (НАИР) в обрезанную область и оставьте Oп кожи на срок до 3 мин.
Аккуратно протрите все для удаления волос средство с теплой, влажной марлей или бумажным полотенцем.
Аккуратно промойте кожу теплой водой и аккуратно высушите область марлей или бумажным полотенцем.
Разрешить животных восстановиться на грелку или под тепловой лампой, и вернуться в свою клетку.

2. День изображений

Развести средство визуализации стерильной водой, затем разбавить использованием стерильного, нормальные (0,85%) физиологическим раствором до достижения 645 мкм (5 мкг/10 мкл) для МКГ или 200 мкм (6,8 мкг/10 мкл) в течение Абд-IRDye800. Хранить в темном решения Условия и использовать в течение 6 часов после разведения.
Место животных в индукционной коробки и степенный изофлураном.
Когда животное находится в состоянии глубокого наркоза (мониторинг с ног щепотку маневра), место седативные животное на бок на пеленки / пух площадки и положение носа в носовой конус связан с газом изофлурана.
Выключите свет (так номертемный). При необходимости, небольшим светом галогенных стол может быть использован для небольшого количества света, чтобы увидеть инъекций.
Использование инсулинового шприца с 31-го калибра иглы, вводят ID 5 мкл до 50 мкл МКГ или Абд-IRDye800 в спинной части каждой задней лапе и / или на левой и правой стороне основания хвоста, в зависимости от интересующей области (см. Обсуждение). Каждый введенной дозы может составлять от 0,083 до 1,25 мг / кг (МКГ) или 0,113 до 1,7 мг / кг (Абд-IRDye800). Инъекции объемы будут меняться в зависимости от штамма животных и месте инъекции. Для бестимусных мышей, объем впрыска может быть 5 мкл (лапы) или 10 мкл (основания хвоста). Если животное не находится под системой визуализации для инъекций (ы), поместить животное в системе формирования изображения сразу после инъекций (ы).
Если нет красителя наблюдается в лимфатические сосуды, шаг 2,5 будет необходимо повторять по мере необходимости на одно животное протокол.
После лимфатические видны, накройте место инъекции с черной изоляционной лентой или черные годовыхпер.
Приобретать лимфатической изображений на срок до 1 часа использованием V + + программного обеспечения и небольших животных, NIRF системы визуализации. (Животные седативные изофлураном и дыхание контролируется в то время как изображения приобретают.) Хотя небольшое животное, NIRF тепловизоры имеются в продаже, мы используем индивидуальный, мелких животных NIRF система визуализации, состоящая из 785-нм лазерный диод (1005-9мм-78503 , Intense, North Brunswick, NJ), оснащенный асферической линзой (C24TME-B, Thorlabs, Ньютон, штат Нью-Джерси), диффузора (ED1-C20, Thorlabs) и фильтр (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ) для создания однородного поля возбуждения, который освещает животных при скорости инцидент влиянием менее 1,4 мВт на квадратный сантиметр ^10. Электронного умножения Устройство с зарядовой связью (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Трентон, штат Нью-Джерси) камера системы с двумя 830-нм фильтра (AND11333, Andover корпорации, Salem, NH) и 28-мм объективом Nikkor (1992, Nikon, Мелвилл, штат Нью-Йорк) используется для захвата изображений с лимфатической интеграции ТимомES 200 мс для динамической визуализации и 800 мс для статических изображений ^5. См. рисунок 1 для настройки системы, таблицы для получения дополнительной информации по каждому компоненту, и обсуждение в течение краткого обсуждения ключевых свойств изображений.
Разрешить животных восстановиться на грелку или под тепловой лампой и вернуться в свою клетку, или усыпить.
Анализ изображений с помощью MATLAB ImageJ или программного обеспечения. См. Рисунок 6.