マウスのリンパ脈管構造の非侵襲的光イメージング

Holly A. Robinson; SunKuk Kwon; Mary A. Hall; John C. Rasmussen; Melissa B. Aldrich; Eva M. Sevick-Muraca

doi:10.3791/4326

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要約
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要約

近赤外蛍光（NIRF）を使用して、最近開発されたイメージング技術は、リンパ系の癌転移、免疫応答、創傷修復、および他のリンパ関連疾患に果たす役割の解明に役立つことがあります。

要約

リンパ脈管系は体液の恒常性を維持し、循環器系の重要な構成要素である、腸内の脂肪吸収免疫監視、および仲介を提供しています。しかし、その重要な機能にもかかわらず、リンパ系は、健康と病気の¹にこれらの機能を果たすために適応する方法の比較的ほとんど理解があります。最近、我々は、近赤外蛍光（NIRF）染料とカスタムは、Gen III - のトレース管理を使用してリンパ管機能不全を患っている人の中でだけでなく、通常のヒト被験者の行動を "ポンピング"動的イメージリンパアーキテクチャやリンパへの能力を実証しているイメージングシステム^2-4を強化した。 NIRFイメージングは、ヒトの疾患とリンパのアーキテクチャおよび機能の劇的な変化を示した。それは、これらの変更が発生すると新しい動物モデルは、それらの遺伝的および分子基盤を解明するために開発されているかは不明のままです。このプロトコルでは、NIRFリンパ、sを提示グリーン（ICG）、ヒトの⁷の50年間使われてきた染料と、優先的にマウスとヒトアルブミン^8をバインドNIRF色素標識巡回アルブミン結合ドメイン（cABD-IRDye800）ペプチドを用いたインドシアニンモール動物イメージング^5,6 。 ICGに比べて約5.5倍明るく、cABD-IRDye800は類似リンパクリアランスプロファイルを有し、イメージング⁸のための十分なNIRF信号を達成するためにICGより少ない用量で注射することができる。 cABD-IRDye800と間隙空間⁸にアルブミンに結合するICG両方あるので、彼らは両方に、リンパ管の中に活性なタンパク質の輸送を示すことができる。皮内（ID）ICGの注射（5-50μL）（645μM）または生理食塩水でcABD-IRDye800（200μM）を各後足および/またはベースの左側と右側の背側面に投与されるイソフルラン麻酔下のマウスの尾。動物で得られた染料濃度は、ICGのため83-1,250μg/ kgの用または113-1,700μg/ kgであるcABD-IRDye800。直ちに注射後、機能的なリンパイメージングは、カスタマイズされた、小動物NIRFイメージングシステムを用いて、最大1時間行われる。全体動物の空間分解能は、100ミクロン以下の蛍光リンパ管を描くことができ、深さが3cmに構造の画像アップが⁹を取得することができる。画像はV + +ソフトウェアを使用して取得すると、ImageJまたはMATLABソフトウェアを使用して分析される。分析時に、全体の血管の直径を包含関心の連続した領域（ROI）が与えられたリンパ管に沿って描かれています。各ROIの寸法が与えられた容器とNIRF強度を一定に保たれる定量的血管を通って移動するリンパの "パケット"を評価するために、各ROIを測定する。

プロトコル

すべての動物実験は、それぞれの施設内動物のケアと使用委員会によってテキサス健康科学センター（テキサス州ヒューストン）の大学比較医学科、およびプロトコルの検討および承認後の分子イメージングのためのセンターの基準に準拠して行った（IACUC）または動物福祉委員会（AWC）。

1。イメージングに先立ち24時間動物の作製

リンパイメージングが行われる前に、以下の手順は、日（必要に応じて）実行する必要があります。

インダクションボックスに動物を置き、イソフルランで落ち着いた。
動物は深い麻酔（つま先ピンチ操縦で監視）、イソフルランガスに接続されているノーズコーンのおむつ/綿毛パッドと位置鼻の上に場所鎮静動物の状態になると。
撮像する領域の周りのすべての髪/毛皮（もしあれば）をクリップします。
クリップされた領域への脱毛剤（Nairさん）を適用して、それはO残すnの最大3分までのスキンです。
優しく暖かい、湿ったガーゼやペーパータオルですべての脱毛剤を拭き取ってください。
優しく暖かい水で皮膚を洗い流し、穏やかにガーゼやペーパータオルを使用して領域を乾燥させてください。
動物は加熱パッドの上に置くか、熱ランプの下で回復することができ、それらのケージに戻ります。

2。イメージングの日

その後滅菌水で再構成するの造影剤、cABD-IRDye800ためICGまたは200μM（6.8μg/10μl）のための645μM（5μg/10μl）を達成するために、通常の滅菌（0.85％）、生理食塩水を用いて希釈してください。 暗闇の中で解決策をキープ条件と再構成の6時間内での使用。
インダクションボックスに動物を置き、イソフルランで落ち着いた。
動物は深い麻酔（つま先ピンチ操縦で監視）、イソフルランガスに接続されているノーズコーンのおむつ/綿毛パッドと位置鼻の上に横向きに場所鎮静動物の状態になると。
（その部屋はライトをオフにする暗い）。必要であれば、小さなデスクハロゲンライトは、注射を見るために、少量の光のために使用することができます。
31ゲージの針を有するインスリン注射器を使用して、に応じて、50 ICGのμlまたは各後足および/または尾の付け根の左側と右側の背側面でcABD-IRDye800にID5μlを注入する関心のある領域（説明を参照）。各注射量は0.083〜1.25 mg / kgの（ICG）または0.113から1.7 mg / kgの（cABD-IRDye800）まで及ぶかもしれません。注入量は、動物の系統と注射部位によって異なります。胸腺欠損マウスでは、注入量は5μl（後足）または10μL（尾の付け根）にすることができます。 動物が注射（s）のイメージングシステム下にない場合は、直後の撮像システムの下に動物を置く注射（秒）。
全く色素の取り込みがリンパ管に見られない場合は、ステップ2.5は動物プロトコルごとに、必要に応じて繰り返す必要があります。
リンパ管が見られたら、黒色の電気テープや黒paで注射部位をカバー当たり。
アップV + +ソフトウェアと小動物、NIRFイメージングシステムを用いて1時間にするために、リンパ管の画像を取得する。（動物はイソフルランで鎮静され、画像が取得されている間呼吸が監視されます。）小動物ながら、NIRFイメージャーは市販されている、我々は、785 nmのレーザーダイオードで構成されるカスタマイズされた、小動物NIRFイメージングシステム（1005〜9ミリメートル-78503を活用、インテンス、ノースブランズウィック、ニュージャージー州）非球面レンズ（C24TME-B Thorlabs、ニュートン、ニュージャージー州）、ディフューザー（ED1-C20、Thorlabs）、フィルタ（LD01-785/10-25、Semrock、ニューヨーク州ロチェスター装備）平方センチメートル当たり¹⁰未満1.4 mWの入射フルエンス率で動物を照らす一様励振フィールドを作成します。 2 830 nmのフィルター（AND11333、アンドーバー社、セーラム、ニューハンプシャー州）と28ミリメートルニッコールレンズ（1992年、ニコン、との電荷結合素子を電子増倍（EMCCD、PhotonMax512、プリンストンインスツルメンツ、トレントン、ニュージャージー州）のカメラシステムメルヴィル、ニューヨーク州）は、統合ティムとリンパの画像をキャプチャするために使用されスタティックイメージング⁵のダイナミックイメージングと800ミリ用に200ミリ秒のES。システム構成、各構成要素の詳細については、表、およびキーイメージャの特性の簡潔な議論のための議論については、 図1を参照してください。
動物は加熱パッドの上に置くか、熱ランプの下で回復するとそのケージに戻るか、安楽死させることができます。
ImageJのか、MATLABソフトウェアを使用して画像を分析します。 図6を参照してください。