Non invasive d'imagerie optique du système vasculaire lymphatique d'une souris

Résumé

Les techniques d'imagerie développées récemment en utilisant la fluorescence dans le proche infrarouge (NIRF) peut aider à élucider le rôle du système lymphatique joue dans les métastases du cancer, la réponse immunitaire, la cicatrisation des plaies, et d'autres maladies associées lymphatique.

Résumé

Le système vasculaire lymphatique est une composante importante du système circulatoire qui maintient l'homéostasie fluide, assure la surveillance immunitaire, et l'absorption de graisse sert d'intermédiaire dans l'intestin. Pourtant, malgré sa fonction critique, il ya relativement peu de compréhension de la façon dont le système lymphatique s'adapte pour répondre à ces fonctions en matière de santé et de la maladie ^1. Récemment, nous avons démontré la capacité de l'architecture dynamiquement l'image lymphatique et de la lymphe "pompage" action sujets humains normaux ainsi que chez les personnes présentant un dysfonctionnement lymphatique en utilisant l'administration trace d'un proche infra-rouge fluorescent (NIRF) colorant et une coutume, Gen III- Système d'imagerie intensifié ^2-4. NIRF imagerie ont montré des changements dramatiques dans l'architecture et la fonction lymphatique avec la maladie humaine. Il reste à savoir comment ces changements se produisent et de nouveaux modèles animaux sont développées pour élucider leur base génétique et moléculaire. Dans ce protocole, nous présentons lymphatique NIRF, sanimaux centre d'imagerie utilisant ^5,6 vert d'indocyanine (ICG), un colorant qui a été utilisé pendant 50 ans chez l'homme ^7, et un NIRF marqué par un colorant cyclique domaine liaison à l'albumine (Abd-IRDye800) peptide qui se lie préférentiellement la souris et l'albumine humaine ⁸ . Environ 5,5 fois plus brillante que l'ICG, Abd-IRDye800 a un profil similaire lymphatique jeu et peut être injecté dans les petites doses de l'ICG pour atteindre signaux NIRF suffisantes pour l'imagerie ^8. Parce que les deux se lient Abd-IRDye800 et ICG à l'albumine dans l'espace interstitiel ^8, ils peuvent représenter à la fois le transport des protéines actif dans et à l'intérieur des vaisseaux lymphatiques. Intradermique (ID) injections (ul 5-50) de l'ICG (645 uM) ou Abd-IRDye800 (200 uM) dans une solution saline sont administrés à la face dorsale de chaque patte arrière et / ou sur le côté gauche et droit de la base de la la queue d'une souris anesthésiée isoflurane. La concentration du colorant résultant de l'animal est 83-1,250 mg / kg pour le GIC ou 113-1,700 mg / kg pourAbd-IRDye800. Immédiatement après les injections, imagerie fonctionnelle lymphatique est réalisée pendant 1 h en utilisant un personnalisé, petit animal NIRF système d'imagerie. Résolution spatiale animal entier peut représenter vaisseaux lymphatiques fluorescentes de 100 microns ou moins, et les images des structures jusqu'à 3 cm de profondeur peut être acquis ^9. Les images sont acquises à l'aide du logiciel V + + et analysées en utilisant le logiciel MATLAB ou ImageJ. Pendant l'analyse, régions consécutives d'intérêt (ROI) englobant le diamètre du vaisseau entier sont attirés le long d'un vaisseau lymphatique donnée. Les dimensions de chaque ROI sont maintenus constants pour un navire donné et l'intensité NIRF est mesurée pour chaque ROI d'évaluer quantitativement «paquets» de la lymphe se déplaçant à travers les vaisseaux.

Protocole

Toutes les études sur les animaux ont été effectuées en conformité avec les normes de l'Université du Texas Health Science Center (Houston, TX), département de médecine comparée et Centre d'imagerie moléculaire, après examen et approbation du protocole par leur soins aux animaux respectifs institutionnel et l'utilisation comité (IACUC) ou Animal Welfare Committee (AWC).

1. Préparation des animaux 24 heures avant à l'imagerie

Les étapes ci-dessous doit être fait (le cas échéant) la veille de l'imagerie lymphatique a lieu.

1. Lieu animal dans une boîte à induction et calme avec de l'isoflurane.
2. Une fois que l'animal est dans un état d'anesthésie profonde (surveillée avec bout-pincement manœuvre), des animaux sous sédation lieu sur un coussin fessier / peluches et le nez position dans un cône de nez raccordés au gaz isoflurane.
3. Pince tous les poils / fourrure (le cas échéant) autour de la zone à imager.
4. Appliquer un agent dépilatoire (NAIR) pour la zone rasée et laissez-on la peau pour un maximum de 3 min.
5. Essuyez doucement avec tout agent dépilatoire chaude, de la gaze humide ou une serviette en papier.
6. Rincer délicatement la peau avec de l'eau tiède et sécher doucement la zone avec de la gaze ou du papier absorbant.
7. Permettre aux animaux de récupérer sur un coussin chauffant ou sous une lampe chauffante, et de retourner dans leur cage.

2. Journée de l'imagerie

1. Agent d'imagerie reconstituer avec de l'eau stérile, puis diluer à l'aide stérile, normale (0,85%) pour atteindre une solution saline 645 uM (5 μg/10 pl) pour le GIC ou 200 pM (6,8 μg/10 pl) pour Abd-IRDye800. Conserver les solutions dans l'obscurité les conditions et les utiliser dans les 6 heures suivant la reconstitution.
2. Lieu animal dans une boîte à induction et calme avec de l'isoflurane.
3. Une fois que l'animal est dans un état d'anesthésie profonde (surveillée avec bout-pincement manœuvre), des animaux sous sédation lieu sur le côté sur un coussin fessier / peluches et le nez position dans un cône de nez raccordés au gaz isoflurane.
4. Éteignez les lumières (si la pièce estsombre). Si nécessaire, une lampe de bureau halogène petite peut être utilisée pour une petite quantité de lumière pour voir injections.
5. En utilisant une seringue à insuline avec une aiguille 31-gauge, injecter ID 5 pl à 50 pl de l'ICG ou Abd-IRDye800 à la face dorsale de chaque patte arrière et / ou sur le côté gauche et droit de la base de la queue, selon la zone d'intérêt (voir Discussion). Chaque dose injectée peut varier de 0,083 à 1,25 mg / kg (ICG) ou 0.113 à 1,7 mg / kg (Abd-IRDye800). Les volumes d'injection varie avec la souche animale et au site d'injection. Pour les souris athymiques, le volume d'injection peut être de 5 pi (patte arrière) ou 10 pi (base de la queue). Si l'animal n'est pas sous le système d'imagerie pour l'injection (s), placer l'animal dans le cadre du système d'imagerie immédiatement après la injection (s).
6. Si aucune absorption de colorant est vu dans les vaisseaux lymphatiques, étape 2.5 sera nécessaire de répéter au besoin selon le protocole animaux.
7. Une fois lymphatiques sont vu, le site d'injection avec du ruban électrique noir ou noir papar.
8. Acquérir les images lymphatiques pour un maximum de 1 heure à l'aide du logiciel V + + et un petit animal, NIRF système d'imagerie. (Les animaux sont mis sous sédation avec de l'isoflurane et la respiration sont surveillés pendant que les images sont l'acquisition.) Alors que les petits animaux, les imageurs NIRF sont disponibles dans le commerce, nous utilisons une mesure, l'imagerie du petit animal NIRF système constitué d'une diode laser 785-nm (1005-9mm-78503 , Intense, North Brunswick, NJ) équipé d'une lentille asphérique (C24TME-B, Thorlabs, Newton, NJ), un diffuseur (ED1-C20, Thorlabs), et le filtre (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ) pour créer un champ d'excitation uniforme qui éclaire l'animal à un débit de fluence incidente de moins de 1,4 mW par centimètre carré ^10. Une multiplication d'électrons à couplage de charges dispositif (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Trenton, NJ) système de caméra avec deux 830-nm filtres (AND11333, Andover Corp, Salem, NH) et une lentille de 28 mm Nikkor (1992, Nikon, Melville, NY) est utilisé pour capturer des images avec une intégration lymphatiques times de 200 ms, pour l'imagerie dynamique et statique 800 msec pour l'imagerie ^5. Voir la figure 1 pour la configuration du système, le tableau pour plus de détails de chaque composant, et la réflexion pour une brève discussion des propriétés imageur clés.
9. Permettre aux animaux de récupérer sur un coussin chauffant ou sous une lampe chauffante et de retourner dans leur cage, ou euthanasier.
10. Analyser des images en utilisant ImageJ ou un logiciel MATLAB. Voir la Figure 6.

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Résultats

Exemple d'imagerie lymphatique NIRF chez la souris

Lorsque ICG ou Abd-IRDye800 est injecté ID à la base de la queue d'une souris normale, la vascularisation lymphatique entre le site d'injection à la base de la queue et du ganglion lymphatique inguinal (LN) doit être immédiatement visualisées. Peu de temps après l'injection (quelques secondes à quelques minutes), le vaisseau lymphatique inguinal entre la LN LN et le axillaire doit être visualisé comme le montre la

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Discussion

Nous utilisons une coutume, petit animal NIRF système d'imagerie pour capturer des images de vaisseaux lymphatiques marquées chez la souris. Pour construire films de mouvement lymphe, plus de 300 images sont recueillies. Pour l'analyse fonctionnelle des vaisseaux lymphatiques de films, deux ou plusieurs ROIs sont manuellement tirée le long d'un vaisseau lymphatique. Les dimensions de la ROI sont maintenues constantes pour chaque navire, et sont à peu près au diamètre de la cuve. Bien que la résolution...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions, réactifs et équipement	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Le vert d'indocyanine (ICG)	Patheon Italia SPA	NDC 25431-424-02	Reconstituer à 645 uM (5 μg/10 pl)
Cyclique Domaine liaison à l'albumine (Abd)	Bachem	Coutume	Reconstituer à 200 uM (6,8 μg/10 pl)
IRDye800	Li-COR	IRDye 800CW	Reconstituer selon les instructions du fabricant; conjuguer avec Abd à des concentrations equilmolar
De l'eau stérile	Hospira, Inc, Lake Forest, IL	NDC 0409-4887-10
NAIR	Church & Dwight Co.,Inc	Magasins locaux	www.nairlikeneverbefore.com
Système d'imagerie (composants ci-dessous)	Center for Molecular Imaging	N / A	Construit sur mesure dans nos laboratoires.
Electron-multiplication charge-coupled device (EMCCD) caméra	Princeton Instruments, Trenton, NJ	Photon max 512
Nikon objectif de la caméra	Nikon Inc, Melville, NY	Modèle n ° 1992, Nikkor 28mm
Filtre optique	Andover Corp, Salem, NH	ANDV11333	Deux filtres passe-bande 830.0/10.0 nm sont utilisés devant l'objectif
Diode laser 785-nm	Intense Ltd, North Brunswick, NJ	1005-9MM-78503	500 mW de sortie optique
Optique de collimation	Thorlabs, Newton, NJ	C240TME-B	Sortie du laser collimate avant filtre de nettoyage
Nettoyage du filtre	Semrock, Inc, Rochester, NY	LD01-785/10-25	Supprime émission laser dans la bande de fluorescence
Diffuseur optique	Thorlabs, Newton, NJ	ED1-C20	Diffuse le laser au-dessus de l'animal
V + +	Optique numérique, Browns Bay, Auckland, Nouvelle-Zélande	Version 5.0	Logiciel utilisé pour contrôler système de caméra et enregistrer des images sur l'ordinateur. http://digitaloptics.net/
			Logiciel d'analyse ou l'autre des logiciels suivants peuvent être utilisés pour l'analyse d'image
ImageJ	National Institutetuts de la santé, Bethesda, MD	Version la plus récente disponible	Freeware disponibles à http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB	The MathWorks, Natick, MA	Version 2008a ou tard	http://www.mathworks.com/