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요약

가까운 적외선 형광 (NIRF)를 사용하여 최근 개발 된 이미징 기술은 림프 시스템의 암 전이에서 활약 역할, 면역 반응, 상처 수리 및 기타 림프 - 관련 질병을 명료하게하다하는 데 도움이 될 수 있습니다.

초록

림프 혈관 시스템은 유체 항상성을 유지 배에 면역 감시 및 mediates 지방 흡수를 제공하는 순환 시스템의 중요한 구성 요소입니다. 그러나 그 중요한 기능에도 불구하고 림프 체계는 건강과 질병 1이 기능을 제공하기 위해 적응하는 방법에 비교적 작은 이해가 있습니다. 최근, 우리는 세대 III는 -, 동적​​ 이미지 림프 건축과 림프 등의 추적에 가까운 적외선 형광 (NIRF) 염료의 관리 및 사용자 정의를 사용하여 림프 장애를 앓고 명에서뿐만 아니라 정상적인 인간의 과목에서 '펌핑'작업 할 수있는 기능을 증명 한 이미징 시스템 2-4 강화. NIRF 영상은 인간의 질병과 림프 아키텍처 및 기능에 극적인 변화를 보여 주었다. 그것은 이러한 변경 사항이 발생하여 새로운 동물 모델의 유전자와 분자 기초를 명료하게하다하기 위해 개발되는지는 확실치 남아 있습니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 NIRF의 림프, S를 제공쇼핑몰 동물 영상 5,6 녹색 (ICG), 인간 7 50 년 동안 사용 된 염료, 그리고 우선적으로 마우스와 인간의 알부민 8 바인딩 NIRF 염료 표시 순환 알부민 결합 도메인 (cABD-IRDye800) 펩타이드를 indocyanine 사용 . ICG보다 약 5.5 배 더 밝아, cABD - IRDye800은 비슷한 림프 통관 프로필을 보유하고 있으며 영상 8 충분한 NIRF 신호를 달성하기 위해 ICG보다 작은 회에 걸쳐 주입 할 수 있습니다. 중간 공간 8 알부민에 모두 cABD - IRDye800과 ICG 구속, 그들은 모두에 그리고 lymphatics에서 활성 단백질 수송을 묘사 할 수 있습니다 때문입니다. Intradermal (ID) ICG의 주사 (5-50 μl의) (645 μM) 또는 생리에 cABD-IRDye800 (200 μM)는 각 뒷다리 앞발로 땅을 차다 및 / 또는의 기초의 왼쪽과 오른쪽의 등 부분에 관리되는 isoflurane - anesthetized 마우스의 꼬리. 동물의 결과 염료 농도는 83-1,250 μg / ICG에 대한 kg 또는 113-1,700 μg / kg을위한 것입니다cABD - IRDye800. 즉시 주사 후, 기능 림프 이미징은 사용자 정의, 작은 동물 NIRF 이미징 시스템을 사용하여 최대 1 시간에 진행됩니다. 전체 동물 공간적 해상도는 깊이 3cm 9 취득 할 수에 구조의 형광 림프 100 마이크론 이하의 선박, 이미지를 묘사 할 수 있습니다. 이미지는 V + + 소프트웨어를 사용하여 인수 ImageJ 또는 MATLAB 소프트웨어를 사용하여 분석하고 있습니다. 분석하는 동안, 전체 선박 직경을 포함한 관심 (ROIs)의 연속 영역은 주어진 림프 혈관을 따라 그려 있습니다. 각 투자 수익 (ROI)에 대한 크기가 양적 림프가 혈관을 통해 이동의 "패킷"을 평가하기 위해 각 투자 수익 (ROI)에 대한 측정 주어진 선박 및 NIRF 강도에 대한 지속적인 유지하고있다.

프로토콜

모든 동물 연구는 텍사스 건강 과학 센터 (휴스턴, TX), 비교 의학 부, 검토 및 해당 기관 동물 케어하여 프로토콜의 승인 후 분자 이미징 센터 대학의 기준에 따라 수행하고위원회를 사용했다 (IACUC) 또는 동물 복지위원회 (AWC).

1. 이미징에 앞서 24 시간 동물의 작성

림프 영상이 일어나기 전에 아래의 단계 일 (필요에 따라)을 수행해야합니다.

  1. 장소 유도 상자에 동물과 isoflurane과 진정.
  2. 동물은 깊이 마취 (발가락 - 핀치 연습과 모니터링), isoflurane 가스에 연결된 코 콘에서 기저귀 / 보풀 패드 및 위치 코 곳 진정제 동물의 상태에되면.
  3. 이미징 될 수있는 영역이 주위 머리카락 / 털을 (해당되는 경우) 클립.
  4. 클립 영역으로 탈모 에이전트 (NAIR)을 적용하고 O 남겨N 최대 3 분까지의 피부.
  5. 부드럽게 따뜻하고 축축한 거즈 나 종이 타월로 모든 탈모 에이전트를 닦아.
  6. 부드럽게 따뜻한 물로 피부를 씻어 부드럽게 거즈 나 종이 타월로 영역을 건조.
  7. 동물 가열 패드 또는 열 램프 아래의 복구, 그들의 케이지로 돌아갈 수 있습니다.

2. 이미징의 날

  1. 멸균 물 Reconstitute 이미징 에이전트 다음 cABD-IRDye800을위한 ICG 또는 200 μM (6.8 μg/10 μl)를 645 μM을 (5 μg/10 μl) 달성하기 위해 멸균, 정상 (0.85 %) 염분을 사용하여 희석. 어둠 속에서 솔루션을 유지 조건과 reconstitution 6 시간 내에 사용.
  2. 장소 유도 상자에 동물과 isoflurane과 진정.
  3. 동물은 깊이 마취 (발가락 - 핀치 연습과 모니터링), isoflurane 가스에 연결된 코 콘에서 기저귀 / 보풀 패드 및 위치 코의 측면에 위치 진정제 동물의 상태에되면.
  4. (그래서 방은 불을 끄고어두운). 필요한 경우, 작은 책상 할로겐 빛이 주사를 볼 수 빛의 작은 양에 사용할 수 있습니다.
  5. 31 게이지 바늘로 인슐린 주사기를 사용에 따라 각 뒷다리 발 /의 등 부분이나 꼬리의 기지의 왼쪽과 오른쪽에있는 ICG 또는 cABD - IRDye800의 50 μl에 ID 5 μl를 주입 관심 영역 (토론 참조). 각 주입 투여 량은 0.083에서 1.25 밀리그램 / kg (ICG) 또는 0.113-1.7 밀리그램 / kg (cABD-IRDye800)로 다양 할 수 있습니다. 사출 볼륨 동물 스트레인, 사출 사이트와 다를 수 있습니다. athymic 마우스의 경우, 사출의 볼륨은 5 μl (뒷다리 앞발로 땅을 차다) 또는 10 μl (꼬리베이스)이 될 수 있습니다. 동물 주입 (들)에 대한 이미징 시스템에서없는 경우, 바로 뒤에 이미징 시스템에서 동물을 배치 주사 (들).
  6. 더 염료 이해가 lymphatics에서 볼 수없는 경우 동물의 프로토콜에 따라 필요한 단계 2.5 반복해야합니다.
  7. 일단 lymphatics이 보이는되며, 검은 색 전기 테이프 나 검은 색 아빠와 주사 사이트를 포함당.
  8. 최대 사용 1 시간에 대한 림프 이미지를 취득 V + + 소프트웨어와 작은 동물, NIRF 이미징 시스템. (동물 isoflurane으로 마취하고 이미지가 인수하는 동안 호흡을 모니터링됩니다.) 작은 동물 있지만, NIRF의 imagers가 상업적으로 사용할 수 있습니다, 우리는 785-nm의 레이저 다이오드로 구성된 사용자 정의, 작은 동물 NIRF 이미징 시스템 (1천5~9밀리미터-78503을 이용 , 강렬한, 노스 비구면 렌즈 (C24TME​​-B, Thorlabs, 뉴턴, NJ), 디퓨저 (ED1-C20, Thorlabs)와 복 브런 즈윅, 뉴저지) 및 필터 (LD01-785/10-25, Semrock, 로체스터, NY ) cm2 당 10 개씩 미만 1.4 MW의 사고 fluence 속도에서 동물을 비춰 균일 여기 필드를 만들 수 있습니다. 전자는 두 830-nm의 필터 (AND11333, 앤도버 공사, 세일럼, NH)와 28 mm Nikkor 렌즈 (1992, 니콘과 카메라 시스템 부과 - 커플 링 장치 (EMCCD, PhotonMax512, 프린스턴 악기, 트 렌튼, NJ) 곱한 멜빌, NY)이 통합 팀과 림프 이미지를 캡처하는 데 사용됩니다정적 이미지 5 동적 이미징 및 800 밀리 초 200 밀리 초의 에스. 시스템 구성, 각 구성 요소의 추가 내용은 표, 키 영상 특성에 대한 간략한 논의에 대한 토론을위한 그림 1을 참조하십시오.
  9. 동물 가열 패드 또는 열 램프 아래의 복구와 케이지로 돌아 오거나 안락사시켜야 할 수 있습니다.
  10. ImageJ 또는 MATLAB 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석합니다. 그림 6을 참조하십시오.

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결과

마우스의 NIRF의 림프 영상의 예

ICG 또는 cABD-IRDye800는 보통 마우스의 꼬리의 기지에서 ID를 주입되면 꼬리의 기지에서 주입 사이트와 사타구니 림프절 (후면) 사이의 림프 vasculature은 즉시 시각화해야합니다. 얼마 주입 후 (몇 초 분), 사타구니 에선과 겨드랑이 에선 사이의 림프 배는 그림 2에서 볼 시각화해야합니다. 그들은 인간처럼 마우스의 lymphatics 동물에서 동?...

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토론

우리는 쥐이라는 림프 혈관의 이미지를 캡처하는 사용자 정의, 작은 동물 NIRF 이미징 시스템을 사용합니다. 림프 운동의 영화를 구성하는 300 개 이상의 이미지를 수집하고 있습니다. 영화에서 lymphatics의 기능 분석을 위해, 두 개 이상의 ROIs를 수동 림프 혈관을 따라 그려 있습니다. ROIs의 크기는 각 선박에 대한 지속적인 유지와 약 혈관의 직경 있습니다. 전체 동물 공간적 해상도가 100 마이크론 이...

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공개

저자는 공개 할 필요가 없어하지만 일부 저자는 특허에 기재되어 있습니다.

감사의 말

NIH R01 CA128919 및 NIH R01 HL092923 :이 작품은 에바 Sevick에 다음 보조금에 의해 지원되었다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
솔루션, 시약 및 장비 회사 카탈로그 번호 코멘트
Indocyanine 녹색 (ICG) Patheon 이탈리아 SPA NDC 25431-424-02 645 μM (5 μg/10 μL)에 Reconstitute
순환 알부민 바인딩 도메인 (cABD) Bachem 관습 200 μM (6.8 μg/10 μL)에 Reconstitute
IRDye800 리튬 COR IRDye 800CW 제조의 지시에 따라 Reconstitute는, equilmolar 농도에 cABD와 어원이 같은 말
멸균 물 Hospira, 주식회사, 레이크 포레스트, IL NDC 0409-4887-10
NAIR 교회 & 드와이트 (주)주식회사 지역 상점 www.nairlikeneverbefore.com
이미징 시스템 (구성 요소 아래) 분자 이미징 센터 N / A 우리 실험실에서 사용자 지정 - 내장.
전자 - 곱 전하 결합 장치 (EMCCD) 카메라 프린스턴 악기, 트 렌튼, NJ 광자 최대 512
니콘 카메라 렌즈 니콘 주식회사, 멜빌, NY 모델 번호 1992 Nikkor 28mm
광학 필터 앤도버 공사, 세일럼, NH ANDV11333 두 830.0/10.0 나노 미터 대역 통과 필터는 렌즈 앞에 사용됩니다
785 나노 미터 레이저 다이오드 강렬한 (주), 노스 브런 즈윅, 뉴저지 1005-9 밀리-78503 광 출력 500 MW
Collimating 광학 Thorlabs, 뉴턴, NJ C240TME-B 이전 정화 필터 Collimates 레이저 출력
청소 필터 Semrock 주식회사, 로체스터, NY LD01-785/10-25 형광 밴드에서 레이저 방출을 제거
광 확산 Thorlabs, 뉴턴, NJ ED1-C20 동물을 통해 레이저를 Diffuses
V + + 디지털 광학, 브라운 베이, 오클랜드, 뉴질랜드 버전 5.0 소프트웨어는 카메라 시스템을 제어하고 컴퓨터에 이미지를 저장하는 데 사용됩니다. http://digitaloptics.net/은
다음과 같은 소프트웨어 패키지의 어느 분석 소프트웨어는 이미지 분석에 사용하실 수 있습니다
ImageJ 국립 Insti건강, 베데스다, MD의 tutes 사용 가능한 최신 버전 에서 프리웨어 가능 http://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks, Natic​​k, MA 버전 2008a 이상 http://www.mathworks.com/

참고문헌

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  5. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
  6. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
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