Não-invasiva de Imagem Óptico da vasculatura linfática de um rato

Holly A. Robinson; SunKuk Kwon; Mary A. Hall; John C. Rasmussen; Melissa B. Aldrich; Eva M. Sevick-Muraca

doi:10.3791/4326

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Neste Artigo

Resumo
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Resumo

Recentemente técnicas de imagem desenvolvidos utilizando fluorescência no infravermelho próximo (NIRF) pode ajudar a elucidar a função do sistema linfático desempenha na metástase do cancro, a resposta imune, reparação de feridas, e outras doenças associadas linfático.

Resumo

O sistema vascular linfático é um componente importante do sistema circulatório, que mantém a homeostase de fluidos, proporciona vigilância imune, e medeia a absorção de gordura no intestino. No entanto, apesar de sua função crítica, há relativamente pouco entendimento de como o sistema linfático se adapta para servir estas funções na saúde e na doença ^1. Recentemente, demonstramos a capacidade de arquitetura dinamicamente imagem linfática e linfa "bombear" ação em indivíduos normais, bem como em pessoas que sofrem de disfunção linfática usando a administração traço de um infravermelho próximo fluorescente corante (NIRF) e um costume, Gen III- intensificou imagens do sistema ^2-4. NIRF imagem mostrou mudanças dramáticas na arquitetura linfática e função com a doença humana. Ainda não está claro como essas mudanças ocorrem e novos modelos animais estão sendo desenvolvidas para elucidar a sua base genética e molecular. Neste protocolo, apresentamos NIRF linfático, sMall animais imagiologia ^5,6 utilizando verde de indocianina (ICG), um corante que tem sido utilizado há 50 anos em humanos ^7, e um corante NIRF marcado albumina domínio de ligação cíclica (CABD-IRDye800) péptido que se liga preferencialmente de rato e humano ⁸ albumina . Aproximadamente 5,5 vezes mais brilhante do que ICG, Abd-IRDye800 tem um perfil semelhante linfático e depuração pode ser injectada em doses menores do que os sinais de ICG para realizar NIRF suficientes para imagiologia ^8. Porque se ligam CABD-IRDye800 ICG e de albumina no espaço intersticial ^8, que tanto pode representar o transporte de proteínas activas para dentro e para dentro dos vasos linfáticos. Intradérmica (ID) injecções (ul 5-50) de ICG (645 uM) ou CABD-IRDye800 (200 fiM) em solução salina são administrados para o aspecto dorsal de cada pata traseira e / ou no lado esquerdo e direito da base do cauda de um rato anestesiado com isoflurano-. A concentração do corante, resultando em que o animal é 83-1,250 ug / kg para o ICG ou 113-1,700 mg / kg paraAbd-IRDye800. Imediatamente após as injeções, imagem funcional linfática é realizada por até 1 hora usando um personalizado, pequenos animais NIRF sistema de imagem. Resolução espacial animal inteiro pode descrever vasos linfáticos fluorescentes de 100 microns ou menos, e as imagens de estruturas até 3 cm de profundidade podem ser adquiridos ^9. As imagens são adquiridas usando V + software + e analisados usando ImageJ ou software MATLAB. Durante a análise, as regiões consecutivos de interesse (ROIs) abrangendo o diâmetro do vaso inteiro são atraídos ao longo de um vaso linfático dado. As dimensões de cada ROI são mantidas constantes para um dado navio e intensidade NIRF é medido para cada ROI para avaliar quantitativamente "pacotes" de linfa em movimento através dos vasos.

Protocolo

Todos os estudos com animais foram realizados de acordo com as normas da Universidade do Texas Health Science Center (Houston, TX), Departamento de Medicina Comparativa e Centro de Imagem Molecular, após análise e aprovação do protocolo pelo seu respectivo Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) ou Comitê de Bem-Estar Animal (CTA).

1. Preparação de Animais 24 horas antes da imagem

Os passos a seguir deve ser feito (conforme necessário) um dia antes de imagem linfática ocorre.

Lugar animal em uma caixa de indução e tranqüilo com isoflurano.
Uma vez que o animal se encontra num estado de anestesia profunda (monitorizado com dedo do pé pinch-manobra), animal sedado lugar sobre uma almofada de tecido / fluff e nariz posição em um cone de nariz ligada a gás isofluorano.
Clipe todo o cabelo / pele (se houver) em torno da área a ser trabalhada.
Aplicar depilatório agente (NAIR) para a área cortada e deixá-lo ón a pele por até 3 min.
Limpe suavemente todo agente depilatório com gaze, quente e úmido ou toalha de papel.
Lave a pele com água morna e seque a área gentilmente com gaze ou toalha de papel.
Permitir que os animais se recuperar em uma almofada de aquecimento ou sob uma lâmpada de calor, e voltar para sua gaiola.

2. Dia da Imagem

Reconstituir agente de imagem com água esterilizada, em seguida, dilua com estéril, normal (0,85%) de solução salina para obter 645 uM (5 μg/10 ul) para ICG ou 200 uM (6,8 ul μg/10) para CABD-IRDye800. Mantenha em soluções escuro condições de uso e dentro de 6 horas de reconstituição.
Lugar animal em uma caixa de indução e tranqüilo com isoflurano.
Uma vez que o animal se encontra num estado de anestesia profunda (monitorizado com dedo do pé pinch-manobra), animal sedado lugar no seu lado sobre uma almofada de tecido / fluff e nariz posição em um cone de nariz ligada a gás isofluorano.
Desligue as luzes (de modo que o quarto éescuro). Se necessário, uma luz de halogéneo pequena mesa pode ser usada para uma pequena quantidade de luz para ver injecções.
Utilizando uma seringa de insulina com uma agulha de 31-gauge, injectar ul ID 5 a 50 ul de ICG ou CABD-IRDye800 no aspecto dorsal de cada pata traseira e / ou no lado esquerdo e direito da base da cauda, dependendo a área de interesse (ver Discussão). Cada dose injectada pode variar 0,083-1,25 mg / kg (ICG) ou 0,113-1,7 mg / kg (CABD-IRDye800). Os volumes de injecção irá variar com a estirpe de animais e no local de injecção. Para ratinhos atímicos, o volume de injecção pode ser 5 (pata traseira) ul ou 10 ul (base da cauda). Se um animal não está sob o sistema de imagem para a injecção (s), colocar o animal no âmbito do sistema de imagem imediatamente após o injecção (ões).
Se nenhuma absorção do corante é visto nos vasos linfáticos, passo 2,5 terá de ser repetido conforme necessário por protocolo animal.
Uma vez linfáticos são vistos, cobrir o local da injecção com fita isolante preta ou preta papor.
Adquirir imagens linfáticos por até 1 hora usando V + + software e um animal pequeno, NIRF sistema de imagem. (Os animais são sedados com isoflurano e respiração são monitoradas enquanto as imagens estão adquirindo.) Embora pequeno animal, imagers NIRF estão comercialmente disponíveis, nós utilizamos um personalizado, pequenos animais NIRF sistema de imagens composto por um diodo laser 785-nm (1005-9mm-78503 , intenso, North Brunswick, NJ) equipada com uma lente asférica (C24TME-B, Thorlabs, Newton, NJ), o difusor (ED1-C20, Thorlabs) e do filtro (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ) para criar um campo de excitação uniforme que ilumina o animal a uma taxa de fluência incidente de menos de 1,4 mW por centímetro quadrado ^10. Um elétron multiplicando cobrado-coupled device (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Trenton, NJ) sistema de câmera com duas 830 nm filtros (AND11333, Andover Corp, Salem, NH) e um de 28 mm lente Nikkor (1992, Nikon, Melville, NY) é usado para capturar imagens linfáticos com integração times de 200 ms para imagens dinâmicas e 800 mseg para imagiologia estático ^5. Veja a Figura 1 para configuração do sistema, a tabela para obter detalhes adicionais de cada componente, e da discussão para uma breve discussão sobre as propriedades imager chave.
Permitir que os animais se recuperar em uma almofada de aquecimento ou sob uma lâmpada de calor e voltar para sua gaiola, ou eutanásia.
Analisar imagens usando ImageJ ou software MATLAB. Veja Figura 6.