Non invasiva di imaging ottico del sistema vascolare linfatico di un mouse

Holly A. Robinson; SunKuk Kwon; Mary A. Hall; John C. Rasmussen; Melissa B. Aldrich; Eva M. Sevick-Muraca

doi:10.3791/4326

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In questo articolo

Riepilogo
Abstract
Protocollo
Risultati
Discussione
Divulgazioni
Riconoscimenti
Materiali
Riferimenti
Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Tecniche di imaging di recente sviluppate utilizzando fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) può aiutare a chiarire il ruolo del sistema linfatico gioca in metastasi del cancro, la risposta immunitaria, la riparazione delle ferite, e altre malattie associate linfatico.

Abstract

Il sistema vascolare linfatico è un componente importante del sistema circolatorio che mantiene l'omeostasi fluido, fornisce la sorveglianza immunitaria, e media l'assorbimento di grassi nell'intestino. Eppure, nonostante la sua funzione critica, non vi è la comprensione relativamente poco di come il sistema linfatico si adatta a servire queste funzioni in materia di salute e malattia ^1. Recentemente, abbiamo dimostrato la capacità di architettura dinamica linfatica immagine e linfa azione "pompaggio" in soggetti umani normali e anche a persone che soffrono di disfunzione linfatica mediante somministrazione traccia di un vicino infrarosso fluorescente (NIRF) colorante e un costume, Gen III- intensificata sistema di imaging ^2-4. NIRF di imaging hanno mostrato cambiamenti drammatici in architettura linfatica e la funzione con la malattia umana. Non è ancora chiaro come questi cambiamenti si verificano e di nuovi modelli animali che sono in fase di sviluppo per chiarire la loro base genetica e molecolare. In questo protocollo, presentiamo linfatico NIRF, small animale Imaging ^5,6 utilizzando verde indocianina (ICG), un colorante che è stato usato per 50 anni nell'uomo ^7, e un colorante marcato NIRF ciclico dominio di legame (CabD-IRDye800) peptide che si lega preferenzialmente topo e albumina umana ⁸ . Circa 5,5 volte più luminoso di ICG, 'Abd-IRDye800 ha un profilo simile gioco linfatico e può essere iniettato in piccole dosi di ICG per ottenere segnali NIRF sufficienti per l'imaging ^8. Poiché sia bind 'Abd-IRDye800 e ICG all'albumina nello spazio interstiziale ^8, entrambi possono descrivere trasporto attivo le proteine in e nei vasi linfatici. Intradermica (ID) iniezioni (microlitri 5-50) di ICG (645 uM) o CabD-IRDye800 (200 pM) in soluzione salina sono somministrati al dorso di ciascuna zampa posteriore e / o il lato sinistro e destro della base del coda di un topo anestetizzato-isoflurano. La concentrazione di colorante conseguente animale è 83-1,250 mcg / kg per ICG o 113-1,700 mg / kg per'Abd-IRDye800. Subito dopo le iniezioni, l'imaging funzionale linfatico è condotto per un massimo di 1 ora con un personalizzato, piccolo sistema animale NIRF imaging. Risoluzione animale intero territorio può rappresentare vasi linfatici fluorescenti di 100 micron o meno, e le immagini di strutture fino a 3 cm di profondità possono essere acquisite ^9. Le immagini sono acquisite in V + software + e analizzati utilizzando il software ImageJ o MATLAB. Durante l'analisi, consecutivi regioni di interesse (ROI) comprende l'intero diametro nave sono disegnati lungo un vaso linfatico dato. Le dimensioni di ogni ROI sono mantenute costanti per un determinato peschereccio e intensità NIRF è misurato per ciascuna ROI per valutare quantitativamente "pacchetti" di linfa si muove attraverso le navi.

Protocollo

Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme della University of Texas Health Science Center (Houston, TX), Dipartimento di Medicina comparativa, e Centro di Imaging Molecolare dopo l'esame e l'approvazione del protocollo da parte loro rispettivi Cura degli animali e uso Comitato Istituzionale (IACUC) o il benessere degli animali Committee (AWC).

1. Preparazione del 24 Hr Animali Prima di Imaging

La procedura che segue deve essere fatto (se necessario) il giorno prima di imaging linfatico avviene.

Inserire animale in una scatola di induzione e sedare con isoflurano.
Una volta che l'animale è in uno stato di anestesia profonda (monitorato con toe-pinch manovra), animale sedato posto su un pannolino / fluff pad naso e la posizione in un cono collegato gas isoflurano.
Agganciare tutti i capelli / pelliccia (se del caso) intorno alla zona da acquisire.
Applicare un agente depilatoria (NAIR) per l'area ritagliata e lasciare on la pelle fino a 3 min.
Pulire delicatamente fuori tutte agente depilatoria con il caldo, garza umida o un tovagliolo di carta.
Lavare delicatamente la pelle con acqua tiepida e asciugare delicatamente la zona con una garza o un tovagliolo di carta.
Consentire agli animali di recuperare su una piastra elettrica o sotto una lampada di calore, e tornare alla loro gabbia.

2. Giorno di Imaging

Agente di imaging Ricostituire con acqua sterile, quindi diluire con sterile, normale (0,85%) soluzione fisiologica per ottenere 645 pM (5 μg/10 pl) per ICG o 200 mM (6.8 μg/10 pl) per 'Abd-IRDye800. Conservare le soluzioni al buio condizioni e l'uso entro 6 ore dalla ricostituzione.
Inserire animale in una scatola di induzione e sedare con isoflurano.
Una volta che l'animale è in uno stato di anestesia profonda (monitorato con toe-pinch manovra), animale sedato posto su un lato su un pannolino / fluff pad naso e la posizione in un cono collegato gas isoflurano.
Spegni le luci (quindi la camera èscuro). Se necessario, una piccola luce alogena scrivania può essere utilizzato per una piccola quantità di luce per vedere iniezioni.
Utilizzando una siringa da insulina con un ago di calibro 31, iniettare ID 5 pl a 50 pl di ICG o CabD-IRDye800 nel dorso di ciascuna zampa posteriore e / o sul lato sinistro e destro della base della coda, a seconda l'area di interesse (vedi Discussione). Ogni dose iniettata può variare 0,083-1,25 mg / kg (ICG) o 0,113-1,7 mg / kg (CabD-IRDye800). Volumi di iniezione varia con il ceppo animale e sito di iniezione. Per topi atimici, il volume di iniezione può essere 5 microlitri (zampa posteriore) o 10 microlitri (base della coda). Se animale non è sotto il sistema di imaging per l'iniezione (s), collocare l'animale sotto il sistema di imaging immediatamente dopo l' iniezione (s).
Se non si vede l'assorbimento colorante nei vasi linfatici, passo 2,5 dovrà essere ripetuta, se necessario per protocollo animale.
Una volta che si vedono vasi linfatici, coprire il sito di iniezione con nastro isolante nero o nero paper.
Acquisire le immagini linfatiche per un massimo di 1 ora con V + software + e un piccolo animale, NIRF sistema di imaging. (Gli animali vengono sedati con isoflurano e respirazione sono monitorati mentre le immagini stanno acquisendo.) Mentre per piccoli animali, imager NIRF sono disponibili in commercio, ci avvaliamo di un personalizzato, piccolo sistema animale NIRF immagini costituito da un 785-nm diodo laser (1005-78503-9mm , intenso, North Brunswick, NJ) dotato di una lente asferica (C24TME-B, Thorlabs, Newton, NJ), diffusore (ED1-C20, Thorlabs), e filtro (LD01-785/10-25, Semrock, Rochester, NY ) per creare un campo uniforme di eccitazione che illumina l'animale a un tasso incidente fluenza inferiore a 1,4 mW per centimetro quadrato ^10. Un elettrone moltiplicando charged-coupled dispositivo (EMCCD, PhotonMax512, Princeton Instruments, Trenton, NJ) sistema di telecamere con due 830-nm (filtri AND11333, Andover Corp., Salem, NH) e da 28 mm, obiettivo Nikkor (1992, Nikon, Melville, NY) viene utilizzato per catturare le immagini linfatici con integrazione times di 200 msec per immagini dinamiche e 800 msec per l'imaging statico ^5. Vedere la Figura 1 per la configurazione del sistema, la tabella per ulteriori dettagli di ogni componente, e la discussione per una breve discussione delle proprietà imager chiave.
Consentire agli animali di recuperare su una piastra elettrica o sotto una lampada di calore e ritornano nella loro gabbia, o eutanasia.
Analizzare le immagini utilizzando ImageJ o software MATLAB. Vedere la Figura 6.