JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שיטות הדמיה שפותחו לאחרונה באמצעות פלואורסצנטי קרוב אינפרא אדום (NIRF) עשויות לעזור להבהיר את תפקיד מערכת הלימפה משחקת בהתפשטות גרורה סרטני, תגובה חיסונית, תיקון פצע, ומחלות אחרות הקשורים לימפטי.

Abstract

מערכת כלי דם הלימפה היא מרכיב חשוב של מערכת הדם ששומר על איזון נוזלים, מספקת מעקב חיסוני, ומתווך ספיגת שומן במעיים. ואולם, למרות הפונקציה הקריטית שלו, יש הבנה מועטת יחסית מאיך מערכת הלימפה מסתגלת לשרת פונקציות אלה במחלה ובריאות 1. לאחרונה, יש לנו הפגנתי יכולת ארכיטקטורה דינמית תמונת הלימפה והלימפה פעולה "שאיבה" בבני אדם רגילים, כמו גם באנשים הסובלים תפקוד הלימפה באמצעות ממשל זכר לצבע קרוב אינפרא האדום ניאון (NIRF) ומותאם אישית, Gen-III התעצם מערכת הדמיה 2-4. NIRF ההדמיה הראתה שינויים דרמטיים בארכיטקטורת הלימפה ולתפקד עם מחלה אנושית. עדיין לא ברור כיצד השינויים הללו מתרחשים ומודלים של בעלי חיים חדשים מפותחים כדי להבהיר בסיס הגנטי ומולקולרי שלהם. בפרוטוקול זה, אנו מציגים הלימפה NIRF, שלקניון חית הדמית 5,6 באמצעות indocyanine ירוק (ICG), צבע ששמש במשך 50 שנים בבני אדם 7, ותחום NIRF צבע הכותרת מחזורי אלבומין מחייב (CABD-IRDye800) פפטיד שנקשר מעדיפים עכבר ו8 אלבומין אנושיים . כ 5.5 פעמים בהירות יותר ICG, CABD-IRDye800 יש פרופיל אישור הלימפה דומה וניתן להזריק במינונים נמוכים יותר מאשר ICG להשיג אותות NIRF מספיקים להדמיה 8. מכיוון שגם לאגד CABD IRDye800-ICG ולאלבומין במרחב הבין 8, שניהם יכולים לתאר תחבורת חלבונים פעילה אל ובתוך lymphatics. Intradermal (ID) זריקות (μl 5-50) של ICG (645 מיקרומטר) או CABD-IRDye800 (200 מיקרומטר) בסליין מנוהלות להיבט הגבי של כל רגלו האחורית ו / או בצד ימין והשמאל של הבסיס זנב של עכבר isoflurane-מורדם. ריכוז צבע וכתוצאה מכך הוא בעלי החיים 83-1,250 מיקרוגרם / ק"ג לICG או 113-1,700 מיקרוגרם / ק"ג עבורCABD-IRDye800. מייד לאחר זריקות, הדמיה תפקודית הלימפה מתבצעת לתקופה של עד 1 שעה באמצעות מערכת מותאמת אישית, חיות קטנה NIRF הדמיה. רזולוציה מרחבית חיים שלמה יכולה לתאר את כלי ניאון הלימפה של 100 מיקרון או פחות, ותמונות של מבנים ל3 סנטימטרי עומק ניתן לרכוש 9. תמונות נרכשה באמצעות V + + תוכנה ונותחה באמצעות ImageJ או תוכנת MATLAB. במהלך ניתוח, אזורים רצופים של ריבית (Rois) המקיפה את קוטר הכלי כולו נמשכים לאורך כלי הלימפה נתונה. הממדים עבור כל ROI נשמרים קבוע לכלי נתון ועוצמת NIRF נמדד עבור כל ROI כמותית להעריך "מנות" של הלימפה עוברת דרך כלי דם.

Protocol

כל המחקרים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לסטנדרטים של אוניברסיטת טקסס למדעי בריאות המרכז (יוסטון, טקסס), מחלקה לרפואה ההשוואתית, ומרכז להדמיה מולקולרית לאחר בדיקה ואישור של הפרוטוקול על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדי שלהם והשתמשו ועדה (IACUC) או צער בעלי חי ועדה (AWC).

1. הכנת בעלי החיים 24 שעות לפני ההדמיה

צריכים לעשות את הצעדים הבאים (במידת צורך) היום לפני הדמית הלימפה מתקיימת.

  1. מקום חיות בתיבת אינדוקציה ורגועה עם isoflurane.
  2. ברגע שבעלי החיים הם במצב של הרדמה עמוקה (מעקב עם תמרון בוהן קמצוץ), מקום חיה מורדמת על משטח חיתול / קצפת ואף עמדה בחרטום חובר לגז isoflurane.
  3. קליפ כל השיער / הפרווה (אם בכלל) באזור להיות צלם.
  4. החל סוכן הסרת שיער (Nair) לאזור המקוטע ולהשאיר אותו on העור לתקופה של עד 3 דקות.
  5. לנגב בעדינות את כל סוכן הסרת השיער עם גזה חמה ולחה או מגבת נייר.
  6. לשטוף בעדינות את העור במים חמים ולייבש בעדינות את האזור עם גזה או מגבת נייר.
  7. אפשר חיות להתאושש על כרית חימום או תחת מנורת חום, ולחזור לכלוב שלהם.

2. היום של הדמיה

  1. סוכן הדמיה לשחזר עם מים סטריליים, אז לדלל שימוש סטרילי, רגיל (0.85%) מלח כדי להשיג 645 מיקרומטר (5 μg/10 μl) לICG או 200 מיקרומטר (6.8 μg/10 μl) לCABD-IRDye800. שמור פתרונות בחושך תנאים ושימוש עד 6 שעות של כינון מחדש.
  2. מקום חיות בתיבת אינדוקציה ורגועה עם isoflurane.
  3. ברגע שבעלי החיים הם במצב של הרדמה עמוקה (מעקב עם תמרון בוהן קמצוץ), מקום חיה מורדמת על צידו על משטח חיתול / קצפת ואף עמדה בחרטום חובר לגז isoflurane.
  4. לכבות את האורות (כך שהחדר הואכהה). במידת צורך, אור הלוגן שולחן קטן יכול לשמש לכמות קטנה של אור כדי לראות זריקות.
  5. שימוש במזרק אינסולין עם מחט 31-מד, להזריק 5 μl מזהים עד 50 μl של ICG או CABD-IRDye800 בהיבט הגבי של כל רגלו האחורית ו / או בצד השמאל וימין של בסיס הזנב, בהתאם האזור של עניין (ראה דיון). כל חומר מוזרק עשוי לנוע 0.083-1.25 מ"ג / ק"ג (ICG) או 0.113-1.7 מ"ג / ק"ג (CABD-IRDye800). כרכי הזרקה ישתנו בזן בעלי חיים והזרקה. לעכברי athymic, נפח ההזרקה יכול להיות 5 (את רגלו אחורית) או 10 μl μl (בסיס הזנב). אם בעל חיים הם לא תחת מערכת ההדמיה להזרקה (הים), הצב את החיה תחת מערכת ההדמיה מייד לאחר הזרקה (הים).
  6. אם אין ספיגה לצבוע הוא ראה בlymphatics, צעד 2.5 יהיה צורך לחזור במידת צורך לפרוטוקול חיה.
  7. ברגע lymphatics נראה, לכסות את אתר ההזרקה בסרט בידוד שחור או רשות שחורהל.
  8. לרכוש תמונות הלימפה של עד 1 שעה באמצעות V + + תוכנה וחיה קטנה, מערכת הדמית NIRF. (בעלי חיים הורדמו עם isoflurane ונשימה מנוטרות בעוד שתמונות רוכשות.) בעוד שחיה קטנה, imagers NIRF זמין מסחרי, אנו מנצלים מערכת מותאמת אישית, חיות קטנה NIRF הדמיה המורכבת של דיודת ליזר 785 ננומטר (1005-9mm-78503 , אינטנסיבי, הצפון ברונסוויק, ניו ג'רזי) לבושה עם עדשה אספריים (C24TME-B, Thorlabs, ניוטון, NJ), מפזר (ED1-C20, Thorlabs), והמסנן (LD01-785/10-25, Semrock, רוצ'סטר, ניו יורק ) כדי ליצור שדה עירור אחיד המאיר את החיים בקצב fluence אירוע של פחות מ 1.4 mW לסנטימטר מרובע 10. אלקטרון הכפלת מכשיר טעון יחד-(EMCCD, PhotonMax512, פרינסטון מכשירים, טרנטון, ניו ג'רזי) מערכת מצלמה עם שני מסננים 830 ננומטר (AND11333, אנדובר קורפ, סאלם, ניו המפשייר) ועדשת Nikkor 28-מ"מ (1992, ניקון, מלוויל, ניו יורק) משמש ללכידת תמונות הלימפה עם שילוב times של 200 אלפיות שני להדמיה דינמית ו800 אלפית שניות להדמיה סטטית 5. ראה איור 1 לתצורת מערכת, לשולחן לפרטים נוספים של כל רכיב, ודיון לדיון קצר של מאפייני imager מפתח.
  9. אפשר חיות להתאושש על כרית חימום או תחת מנורת חום ולחזור לכלוב שלהם, או להרדים.
  10. נתח את התמונות באמצעות ImageJ או תוכנת MATLAB. ראה איור 6.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

דוגמה להדמית הלימפה NIRF בעכברים

כאשר ICG או CABD-IRDye800 מוזרק מזהה בבסיס הזנב של עכבר רגיל, מערכת כלי דם הלימפה בין אתר ההזרקה בבסיס הזנב והבלוטות לימפה מפשעתי (LN) צריכה להיות מייד דמיינה. זמן קצר לאחר הזרקה (כמה שניות עד דקות), כלי הלימפ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

אנו משתמשים במערכה אישית, חיות קטנה NIRF הדמיה כדי ללכוד תמונות של כלי הלימפה שכותרתו בעכברים. לבנות סרטים של תנועת הלימפה, 300 או יותר תמונות שנאספו. לניתוח פונקציונלי של lymphatics מסרטים, שתיים או יותר Rois מצויר ידני יחד כלי הלימפה. מידותיו של Rois נשמרות קבועה לכל כלי והן כ הק?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

סופרים אין לי מה לחשוף, אבל כמה מחברים רשומים בפטנט.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים לאוות Sevick: NIH R01 CA128919 וNIH R01 HL092923.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
פתרונות, ריאגנטים וציוד חברה מספר קטלוגים תגובות
Indocyanine ירוק (ICG) Patheon Italia SPA NDC 25431-424-02 תשקם ל645 מיקרומטר (5 μg/10 μL)
דומיין העקידה אלבומין מחזורי (CABD) Bachem מנהג לשקם עד 200 מיקרומטר (6.8 μg/10 μL)
IRDye800 Li-COR IRDye 800CW לשחזר לפי הוראות הייצור; להטות עם CABD בריכוזי equilmolar
מים סטריליים Hospira, Inc, בלייק פורסט, אילינוי NDC 0409-4887-10
תאיר הכנסייה & דווייט ושות,בע"מ חנויות מקומיות www.nairlikeneverbefore.com
הדמית המערכת (רכיבים בהמשך) מרכז להדמיה מולקולרית N / מותאם אישית שנבנה במעבדות שלנו.
תשלום מצמידי מכשיר מצלמת אלקטרונים הכפלה (EMCCD) פרינסטון מכשירים, טרנטון, ניו ג'רזי פוטון מקס 512
ניקון עדשת מצלמה ניקון Inc, מלוויל, ניו יורק דגם מספר 1992, Nikkor 28mm
מסנן אופטי אנדובר קורפ, סאלם, ניו המפשייר ANDV11333 שני 830.0/10.0 מסנני bandpass ננומטר משמשים בחזית העדשה
דיודת ליזר 785 ננומטר בע"מ האינטנסיבי, צפון ברונסוויק, ניו ג'רזי 1005-9mm-78503 500 מגה ואט של פלט אופטי
אופטיקה Collimating Thorlabs, ניוטון, NJ C240TME-B Collimates פלט ליזר לפני ניקוי מסנן
מסנן לנקות Semrock, Inc, רוצ'סטר, ניו יורק LD01-785/10-25 מסיר פליטת ליזר בלהקת פלואורסצנטי
מפזר אופטי Thorlabs, ניוטון, NJ ED1-C20 מפזר את הליזר על בעלי החיים
V + + אופטיקה הדיגיטלית, ראונס ביי, אוקלנד, ניו זילנד גרסת 5.0 תוכנה משמשת לשליטת מערכת מצלמה ולשמור את תמונות למחשב. Http://digitaloptics.net/
תוכנה אנליטית או של חבילות התוכנה הבאות יכולה לשמש לניתוח תמונה
ImageJ Insti הלאומיtutes בריאות, Bethesda, MD גרסה העדכנית ביותר זמינה זמין Freeware בhttp://rsbweb.nih.gov/ij/
MATLAB MathWorks, נאטיק, MA גרסת 2008a או במאוחר http://www.mathworks.com/

References

  1. Alitalo, K. The lymphatic vasculature in disease. Nat. Med. 17, 1371-1380 (2011).
  2. Rasmussen, J. C., Tan, I. C., Marshall, M. V., Fife, C. E., Sevick-Muraca, E. M. Lymphatic imaging in humans with near-infrared fluorescence. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 74-82 (2009).
  3. Rasmussen, J. C., et al. Human Lymphatic Architecture and Dynamic Transport Imaged Using Near-infrared Fluorescence. Transl. Oncol. 3, 362-372 (2010).
  4. Sevick-Muraca, E. M. Translation of near-infrared fluorescence imaging technologies: emerging clinical applications. Annu. Rev. Med. 63, 217-231 (2012).
  5. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Noninvasive quantitative imaging of lymph function in mice. Lymphat. Res. Biol. 5, 219-231 (2007).
  6. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Mouse phenotyping with near-infrared fluorescence lymphatic imaging. Biomed Opt Express. 2, 1403-1411 (2011).
  7. Marshall, M. V., et al. Near-infrared fluorescence imaging in humans with indocyanine green: a review and update. The Open Surgical Oncology Journal. 2, 12-25 (2010).
  8. Davies-Venn, C. A., et al. Albumin-Binding Domain Conjugate for Near-Infrared Fluorescence Lymphatic Imaging. Mol. Imaging Biol. , (2011).
  9. Sharma, R. Quantitative imaging of lymph function. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292, 3109-3118 (2007).
  10. Kwon, S., Sevick-Muraca, E. M. Functional lymphatic imaging in tumor-bearing mice. J. Immunol. Methods. 360, 167-172 (2010).
  11. Karlsen, T. V., McCormack, E., Mujic, M., Tenstad, O., Wiig, H. Minimally invasive quantification of lymph flow in mice and rats by imaging depot clearance of near-infrared albumin. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 391-401 (2012).
  12. Zhou, Q., Wood, R., Schwarz, E. M., Wang, Y. J., Xing, L. Near-infrared lymphatic imaging demonstrates the dynamics of lymph flow and lymphangiogenesis during the acute versus chronic phases of arthritis in mice. Arthritis Rheum. 62, 1881-1889 (2010).
  13. Adams, K. E., et al. Direct evidence of lymphatic function improvement after advanced pneumatic compression device treatment of lymphedema. Biomed. Opt. Express. 1, 114-125 (2010).
  14. Tan, I. C., et al. Assessment of lymphatic contractile function after manual lymphatic drainage using near-infrared fluorescence imaging. Arch. Phys. Med. Rehabil. 92, 756-764 (2011).
  15. Lapinski, P. E., et al. RASA1 maintains the lymphatic vasculature in a quiescent functional state in mice. J. Clin. Invest. 122, 733-747 (2012).
  16. Maus, E. A., et al. Near-infrared fluorescence imaging of lymphatics in head and neck lymphedema. Head Neck. 34, 448-453 (2012).
  17. Galanzha, E. I., Tuchin, V. V., Zharov, V. P. Advances in small animal mesentery models for in vivo flow cytometry, dynamic microscopy, and drug screening. World J. Gastroenterol. 13, 192-218 (2007).
  18. Schramm, R., et al. The cervical lymph node preparation: a novel approach to study lymphocyte homing by intravital microscopy. Inflammation research : official journal of the European Histamine Research Society. 55, 160-167 (2006).
  19. Hall, M. A., et al. Imaging prostate cancer lymph node metastases with a multimodality contrast agent. Prostate. 72, 129-146 (2012).
  20. Zhu, B., Sevick-Muraca, E. M. Minimizing excitation leakage and maximizing measurement sensitivity for molecular imaging with near-infrared fluorescence. J. Innovat. Opt. Health Sci. 4, 301-307 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

73

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved