Análisis de contenido de ácido graso y Composición en microalgas

Resumen

Un método para la determinación del contenido de ácido graso y la composición en microalgas basado en disrupción mecánica celular, extracción de lípidos a base de disolvente, de transesterificación, y la cuantificación e identificación de los ácidos grasos utilizando cromatografía de gases se describe. Un estándar interno tripentadecanoin se utiliza para compensar las posibles pérdidas durante la extracción y la transesterificación incompleta.

Resumen

Un método para determinar el contenido y la composición de ácidos grasos totales presentes en microalgas se describe. Los ácidos grasos son un componente importante de la biomasa de microalgas. Estos ácidos grasos pueden estar presentes en diferentes clases-acilo de los lípidos. Especialmente los ácidos grasos presentes en los triglicéridos (TAG) son de interés comercial, ya que pueden ser utilizados para la producción de combustibles para el transporte, los productos químicos a granel, nutracéuticos (ácidos grasos ω-3), y los productos alimenticios. Para desarrollar aplicaciones comerciales, se necesitan métodos analíticos fiables para la cuantificación del contenido de ácidos grasos y la composición. Las microalgas son células individuales rodeadas por una pared celular rígida. Un método de análisis de ácidos grasos debe proporcionar suficiente disrupción celular para liberar todos los lípidos de acilo y el procedimiento de extracción utilizado debe ser capaz de extraer todas las clases de lípidos acilo.

Con el método presentado aquí todos los ácidos grasos presentes en microalgas pueden ser precisa y reproducible idennotificada y cuantificado usando pequeñas cantidades de muestra (5 mg) independientes de su longitud de cadena, grado de insaturación, o la clase de lípidos que son parte de.

Este método no proporciona información sobre la abundancia relativa de las diferentes clases de lípidos, pero se puede ampliar para separar clases de lípidos entre sí.

El método se basa en una secuencia de disrupción mecánica celular, extracción de lípidos a base de disolvente, transesterificación de los ácidos grasos a ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs), y la cuantificación e identificación de FAME, usando la cromatografía de gases (GC-FID). Una norma interna TAG (tripentadecanoin) se añade antes del procedimiento analítico para corregir las pérdidas durante la extracción y transesterificación incompleta.

Introducción

Los ácidos grasos son uno de los principales constituyentes de biomasa de microalgas y típicamente constituyen entre 5-50% del peso seco celular ^1-3. Ellos son principalmente presente en la forma de glicerolípidos. Estos, a su vez glicerolípidos consisten principalmente en fosfolípidos, glicolípidos y triacilglicerol (TAG). Especialmente los ácidos grasos presentes en TAG son de interés comercial, debido a que pueden ser utilizados como un recurso para la producción de combustibles para el transporte, productos químicos a granel, nutracéuticos (ácidos grasos ω-3), y los productos alimenticios ^3-6. Las microalgas pueden crecer en medios de cultivo a base de agua de mar, puede tener una productividad mucho más alta de área de las plantas terrestres, y puede ser cultivada en fotobiorreactores en lugares que no son aptos para la agricultura, posiblemente, incluso en alta mar. Por estas razones, las microalgas se consideran a menudo una alternativa prometedora a las plantas terrestres para la producción de biodiesel y otros productos a granel ^6.3. Potencialmente no l agrícolay o agua dulce es necesaria para su producción (cuando se cultiva en fotobiorreactores cerrados o cuando se utilizan las microalgas marinas). Por lo tanto, los biocombustibles derivados de las microalgas se consideran biocombustibles 3 ^ª generación.

El contenido celular total de ácidos grasos (% de peso seco), la composición de clase de lípidos, así como la longitud de los ácidos grasos y el grado de saturación son muy variable entre las especies de microalgas. Además, estas propiedades varían con las condiciones de cultivo, tales como la disponibilidad de nutrientes, temperatura, pH, intensidad de la luz y ^1,2. Por ejemplo, cuando se expone a la inanición de nitrógeno, las microalgas pueden acumular grandes cantidades de TAG. En condiciones óptimas de crecimiento TAG constituye típicamente menos de 2% de peso seco, pero cuando se expone a la inanición de nitrógeno contenido de la etiqueta puede aumentar hasta el 40% del peso seco de microalgas ^1.

Las microalgas producen principalmente ácidos grasos con longitudes de cadena de 16 y 18átomos de carbono, pero algunas especies pueden hacer que los ácidos grasos de hasta 24 átomos de carbono de longitud. Tanto saturada, así como ácidos grasos altamente insaturados son producidos por microalgas. Estos últimos incluyen los ácidos grasos con beneficios nutricionales (ácidos grasos ω-3) como C20: 5 (ácido eicosapentaenoico, EPA) y C22: 6 (ácido docosahexaenoico, DHA) para los que no existen alternativas vegetales ^1,2,4,7. El (distribución de) ácidos grasos de longitud de cadena y grado de saturación también determina las propiedades y la calidad de los biocombustibles derivados de algas y aceites comestibles ^4,8.

Para desarrollar aplicaciones comerciales de los ácidos grasos de microalgas derivada, se necesitan métodos analíticos fiables para la cuantificación del contenido de ácidos grasos y la composición.

Como también se ha señalado Ryckebosch et al. ^9, el análisis de los ácidos grasos en las microalgas se distingue de otros sustratos (por ejemplo, aceite vegetal, productos alimenticios, tejidos animales, etc) sercausar 1) microalgas son células individuales rodeadas por paredes celulares rígidas, lo que complica la extracción de lípidos; 2) microalgas contienen una amplia variedad de clases de lípidos y la distribución de clases de lípidos es muy variable ^7. Estas diferentes clases de lípidos tienen una amplia variedad en la estructura química y las propiedades tales como la polaridad. Además, se producen otras clases de lípidos que los lípidos acilo; 3) microalgas contienen una amplia variedad de ácidos grasos, que van desde 12 hasta 24 átomos de carbono de longitud y que contiene tanto saturados, así como ácidos grasos altamente insaturados. Por lo tanto, los métodos desarrollados para analizar ácidos grasos en sustratos distintos de microalgas, podrían no ser adecuados para analizar los ácidos grasos en microalgas.

Como revisado por Ryckebosch et al. ^9, la principal diferencia entre los procedimientos de extracción de lípidos de uso común es en los sistemas de disolventes que se utilizan. Debido a la gran variedad de clases de lípidos presentes en microalgas, cada uno que varía en la polaridad, la extraídacantidad de lípidos variará con disolventes utilizados ^10-12. Esto lleva a las inconsistencias en el contenido de lípidos y la composición se presenta en ^9,10 literatura. Dependiendo del sistema disolvente utilizado, los métodos basados ​​en extracción con disolventes y sin interrupción de la célula a través de, por ejemplo, latidos del grano o sonicación, podrían no extraer todos los lípidos debido a la estructura rígida de algunas especies de microalgas ^9,13. En el caso de la extracción de lípidos incompleta, la eficacia de la extracción de las diferentes clases de lípidos puede variar ^14. Esto también puede tener un efecto sobre la composición de ácidos grasos medido, porque la composición de ácidos grasos es variable entre las clases de lípidos ^7.

Nuestro método se basa en una secuencia de disrupción mecánica celular, extracción de lípidos a base de disolvente, transesterificación de los ácidos grasos a ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs), y la cuantificación e identificación de FAME utilizando cromatografía de gases en combinación con una ionización de llamadetector ción (GC-FID). Un patrón interno en la forma de triglicéridos (tripentadecanoin) se añade antes del procedimiento analítico. Las posibles pérdidas durante la extracción y transesterificación incompleta pueden ser corregidos para. El método puede ser utilizado para determinar el contenido, así como la composición de los ácidos grasos presentes en la biomasa de microalgas. Todos los ácidos grasos presentes en las diferentes clases-acilo de los lípidos, incluido el almacenamiento (TAG), así como los lípidos de membrana (glicolípidos, fosfolípidos), son detectados, identificados y cuantificados con precisión y de forma reproducible por este método usando sólo pequeñas cantidades de muestra (5 mg) . Este método no proporciona información sobre la abundancia relativa de las diferentes clases de lípidos. Sin embargo, el método se puede ampliar para separar clases de lípidos entre sí ^1. La composición de ácidos grasos y la concentración de las diferentes clases de lípidos se puede determinar individualmente.

En la literatura varios otros métodos sondescrito para analizar los lípidos en microalgas. Algunos métodos se centran en componentes lipofílicos total de ^15, mientras que otros métodos se centran en los ácidos grasos totales ^9,16. Estas alternativas incluyen la determinación gravimétrica del total de lípidos extraídos, trans-esterificación directa de los ácidos grasos combinados con la cuantificación mediante cromatografía y tinción de las células con tintes fluorescentes lipofílicos.

Una alternativa comúnmente utilizado para la cuantificación de ácidos grasos, usando la cromatografía es la cuantificación de los lípidos utilizando una determinación gravimétrica ^17,18. Ventajas de una determinación gravimétrica son la falta de requisitos para el equipo avanzado y caro como un cromatógrafo de gases, la facilidad para establecer el procedimiento, debido a la disponibilidad de aparatos de análisis estandarizado (por ejemplo Soxhlet), y una determinación gravimétrica es menos tiempo que la cromatografía de métodos basados ​​en. La principal ventaja de la utilización de métodos de cromatografía basado en la OTHER mano es que en un procedimiento de este tipo sólo se miden los ácidos grasos. En una determinación gravimétrica del ácido no graso que contiene lípidos, como los pigmentos o los esteroides, también se incluyen en la determinación. Estos lípidos de ácido no graso que contiene pueden constituir una gran proporción (> 50%) de los lípidos totales. Si uno está interesado sólo en el contenido de ácidos grasos (por ejemplo, para aplicaciones de biodiesel), se sobreestimó cuando se utiliza una determinación gravimétrica. Además, en una determinación gravimétrica la exactitud de la balanza analítica utilizada para pesar los lípidos extraídos determina el tamaño de la muestra que debe ser utilizado. Esta cantidad es típicamente mucho más de la cantidad necesaria cuando se utiliza cromatografía. Por último, otra de las ventajas de la utilización de cromatografía sobre determinación gravimétrica es que la cromatografía se proporciona información acerca de la composición de ácidos grasos.

Otra alternativa a la aplicación de este método se presenta es ^16,19,20 transesterificación directa.En este método de extracción de lípidos y la transesterificación de los ácidos grasos a FAME se combinan en un solo paso. Este método es más rápido que una etapa de extracción y la transesterificación por separado, pero la combinación de estos pasos limita los disolventes que se pueden utilizar para la extracción. Esto podría influir negativamente en la eficiencia de extracción. Otra ventaja de una etapa de extracción de lípidos y transesterificación separada es que permite para una separación adicional de la clase de lípidos entre estos pasos ^1. Esto no es posible cuando se utiliza transesterificación directa.

Otros métodos comúnmente utilizados para determinar el contenido de lípidos en microalgas incluyen la tinción de la biomasa con manchas fluorescentes lipófilos tales como Rojo Nilo o BODIPY y la medición de la señal de fluorescencia ^21,22. Una ventaja de estos métodos es que son menos laborioso que los métodos alternativos. Una desventaja de estos métodos es que la respuesta fluorescente es, por diversas razones, variable entre especies, las condiciones de cultivo, clases de lípidos, y los procedimientos analíticos. Como un ejemplo, varias de estas variaciones son causadas por diferencias en la captación del colorante por las microalgas. Por lo tanto, se necesita calibración utilizando otro método cuantitativo, realizado preferentemente para todas las diferentes condiciones de cultivo y etapas de crecimiento. Por último, este método no proporciona información acerca de la composición de ácidos grasos y es menos precisa y reproducible que los métodos cromatográficos basados.

El método que se presenta se basa en el método descrito por Lamers et al. ²³ y Santos et al. ²⁴ y también se ha aplicado por varios otros autores ^1,25-27. También están disponibles otros métodos que se basan en los mismos principios y podrían proporcionar resultados similares ^9,28.

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Protocolo

1. Preparación de la muestra

Hay dos protocolos alternativos para la preparación de muestras como etapas 1,1 y 1,2. Ambos métodos son igualmente adecuadas y dan resultados similares, pero si una cantidad limitada de volumen de cultivo de algas está disponible, se recomienda el método 1.1.

NOTA: Para cualquiera de los protocolos, preparar dos tubos de batidor de bolas adicionales de acuerdo con todo el protocolo, pero sin adición de algas a ellos para ser utilizado como un espacio en blanco. De esta manera, los picos en el cromatograma GC resultante de la extracción de los componentes de los materiales utilizados pueden ser identificados y cuantificados.

1.1. Muestra Protocolo Preparación Opción 1: Recomendada cuando una cantidad limitada de Algas cultura es Disponible

1. Determinar la concentración en peso seco de algas (g / l) en el caldo de cultivo, por ejemplo como se describe por Breuer et al. ^1.
2. Transferir un volumen de caldo de cultivo que contiene 5-10 mg de peso seco de las algasun tubo de centrífuga de vidrio. Calcular la cantidad exacta de biomasa transferida mediante la concentración de biomasa determinada en el paso 1.1.1.
3. Centrifugar 5 min a 1200 x g.
4. Deseche parte del sobrenadante, deje aproximadamente 0,25 ml en el tubo.
5. Volver a suspender las algas en el sobrenadante restante por suave pipeteando el sedimento arriba y hacia abajo y transferir el sedimento celular completa a un tubo de batidor de bolas utilizando una pipeta de 200 l.
6. Enjuague el tubo de centrífuga y el vidrio de la pipeta con agua ± 0,15 ml milliQ y transferir el líquido al mismo tubo batidor de bolas.
7. Tubos de centrífuga de talón batidora durante un minuto a máxima rpm para asegurarse de que no queden burbujas de aire en la parte inferior de los tubos. Es posible almacenar tubos batidor de bolas cerrados a -80 ° C.
8. Liofilizar los tubos batidor de bolas que contienen la muestra. Es posible almacenar los tubos de batidor de bolas cerrados a -80 ° C.

1.2. Ejemplo de opción de protocolo Preparación 2

1. Centrifugar un volumen indeterminado de caldo de cultivo de algas y desechar el sobrenadante. No es necesario para determinar la concentración de biomasa o para medir el volumen utilizado.
2. Medir o calcular la osmolaridad del medio de cultivo utilizando la concentración de las principales sales presentes en el medio de cultivo.
3. Lavar el sedimento de células resuspendiendo el sedimento celular en el mismo volumen, tal como se utiliza en el paso 1.2.1, de una solución de formiato de amonio, que se aproxima a la osmolaridad del medio de cultivo. Una solución de formiato de amonio equiosmolar impide la lisis de células durante el lavado de las células.

NOTA: El lavado de las células es necesario para eliminar las sales presentes en el medio de cultivo. Esto es especialmente importante para el análisis de ácidos grasos en microalgas marinas debido a las altas concentraciones de sal en su medio de cultivo. Si sales podrían estar aún presente, esto haría que la sobreestimación de la cantidad de peso seco de células que se determinará más adelante en tsu protocolo. Formiato de amonio se utiliza para lavar las células porque esta solución se evapora completamente durante la liofilización y no deja ningún residuo.

4. Suspensión Centrífuga algas y sobrenadante de descarte.
5. Liofilizar el sedimento celular.
6. Pesar 5-10 mg de polvo liofilizado de microalgas en un tubo batidor de bolas. Anotar el peso exacto.

2. La interrupción de la célula y de los lípidos de Extracción

NOTA: En esta sección se describe un procedimiento extenso ruptura celular. Posiblemente, algunos de los pasos disrupción celular son redundantes y menos extensa interrupción de la célula podría producir los mismos resultados para algunas especies de microalgas o para la biomasa derivada de ciertas condiciones de cultivo. Esto necesitaría de validación para cada situación específica sin embargo. Por lo tanto el protocolo de interrupción extensa propuesta se recomienda como un método universal apto para todo el material de microalgas.

1. Pesar una cantidad exacta de tripentadecanoin (triacylglycerol contiene tres C15: ácidos grasos 0) y agregarlo a una cantidad exactamente conocida de 04:05 (v / v) de cloroformo: metanol. De esta manera se conoce exactamente la concentración de tripentadecanoin. Apunta a una concentración de 50 mg / L. Tripentadecanoin sirve como el patrón interno para la cuantificación de ácidos grasos.
2. Añadir 1 ml de cloroformo: metanol 04:05 (v / v) que contiene tripentadecanoin a cada tubo de golpeo (especificado en los reactivos y equipos de mesa). Compruebe que no hay cuentas restantes dentro de la tapa del tubo BeadBeater, esto dará lugar a fugas de los tubos. Utilizar una pipeta de desplazamiento positivo para la adición precisa de disolventes.
3. Bolas venció a los tubos batidor de bolas 8x a 2.500 rpm durante 60 segundos, cada vez con un 120 sec interna entre cada latido.
4. Transferir la solución de los tubos dosificadores de vidrio hasta un 15 ml tubo de centrífuga de vidrio resistente al calor limpio con inserto de teflón tapones de rosca. Asegúrese de transferir todas las cuentas del tubo batidor de bolas también.
5. Para erah, el tubo de batidor de bolas, añadir 1 ml de cloroformo: metanol 4:5 (v / v) que contiene tripentadecanoin en el tubo de batidor de bolas, cerca de la tapa y mezclar, y transferir esta solución a la misma tubo de vidrio desde el paso 2.4. Lavar el tubo tres veces (en total de 4 ml de cloroformo: metanol 04:05 (v / v) que contiene tripentadecanoin se utiliza por muestra - 1 ml Añadido en el paso 2.2 y 3 ml para 3 etapas de lavado).
6. Vortex los tubos de vidrio para 5 seg y se somete a ultrasonidos en un baño de sonicación durante 10 min.
7. Añadir 2,5 ml de agua MilliQ, que contiene 50 mM de 2-amino-2-hidroximetil-propano-1 ,3-diol (Tris) y 1 M de NaCl, que se ajusta a pH 7 utilizando una solución de HCl. Esto causará una separación de fase entre cloroformo y metanol: agua. 1 M de NaCl se utiliza para mejorar el equilibrio de los lípidos hacia la fase de cloroformo.
8. Vortex durante 5 segundos y luego se somete a ultrasonidos durante 10 min.
9. Centrifugar durante 5 min a 1200 x g.
10. Transferir toda la fase de cloroformo (fase inferior) a un tubo de vidrio limpio usando un pipetee Pasteur de vidrioe. Asegúrese de no transferir ninguna interfase o fase superior.
11. Volver a extraer la muestra mediante la adición de 1 ml de cloroformo al tubo de edad (que contiene el metanol: solución de agua).
12. Vortex durante 5 segundos y luego se somete a ultrasonidos durante 10 min.
13. Centrifugar durante 5 min a 1200 x g.
14. Recoger la fase cloroformo (fase inferior) con una pipeta Pasteur de vidrio y de la piscina con la primera fracción de cloroformo desde el paso 2.10.
15. Si se experimentan dificultades en la recopilación de toda la fracción de cloroformo en el paso anterior, repita los pasos del 02.11 a 02.14. De lo contrario, continúe con el paso 2.16.
16. Evaporar el cloroformo del tubo en una corriente de gas nitrógeno. Después de este paso muestras se pueden almacenar a -20 ° C bajo una atmósfera de gas nitrógeno.

3. La transesterificación de ésteres metílicos de ácidos grasos

1. Añadir 3 ml de metanol que contiene 5% (v / v) de ácido sulfúrico al tubo que contiene los lípidos extraídos se secaron (tubo originalmente que contienen la fracción de cloroformo) ycerrar el tubo bien.
2. Vortex durante 5 segundos.
3. Incubar las muestras durante 3 horas a 70 ° C en un calentador de bloque o al baño maría. Periódicamente (cada ± 30 min) asegurarse de que las muestras no están en ebullición (causada por una tapa mal cerrada) y tubos de vórtice. Durante esta reacción los ácidos grasos están metilados en sus ésteres metílicos de ácidos grasos (FAMEs).
4. Enfriar las muestras a temperatura ambiente y añadir 3 ml de agua MilliQ y 3 ml de n-hexano.
5. Vortex durante 5 segundos y se mezcla durante 15 min con un rotador tubo de ensayo.
6. Centrifugar durante 5 min a 1200 x g.
7. Recoger 2 ml de la fase de hexano (arriba) y poner en tubo de vidrio fresco con una pipeta Pasteur de vidrio.
8. Agregue el agua 2 ml MilliQ a la fase de hexano recogido para lavarlo.
9. Vortex durante 5 segundos y centrifugar durante 5 min a 1200 x g. Después de este paso es posible almacenar las muestras a -20 ° C bajo atmósfera de gas nitrógeno (separación de fase no es necesario).

4. Cuantificación de FAME Using cromatografía de gases

1. Rellenar viales de GC con la fase de hexano (fase superior) usando una pipeta Pasteur de vidrio.
2. Coloque las tapas de los viales de GC. Asegúrese de que las tapas están completamente sellados y no se pueden dar vuelta, para evitar la evaporación del vial.
3. Vuelva a llenar los disolventes de lavado GC (hexano), vaciar los viales de desecho, y poner los viales de muestra en auto-muestreador. Antes de ejecutar las muestras reales en el GC, la primera carrera 2 espacios en blanco que contienen sólo hexano en el GC.
4. Ejecute las muestras en un GC-FID con una columna Nukol (30 mx 0,53 mm x 1,0 m). Utilice temperatura de entrada de 250 ° C y usar helio como gas portador, la presión de 81,7 kPa y relación de división de 0,1:1, velocidad de flujo total: 20 ml / min. Temperatura del detector FID de 270 º C con H ₂ tasa de flujo de 40 ml / min, caudal de aire de 400 ml / min y Él tasa de 9,3 ml / min de caudal. Volumen de inyección Puesto a 1 l / muestra. Inyector Pre y lavado posterior con n-hexano. Temperatura inicial de la estufa se establece en 90 ° C durante 0,5 min y después se elevó ingenioh 20 ° hasta una temperatura del horno de 200 ° C se alcanza C / min. La temperatura del horno se mantiene entonces a 200 ° C durante 39 min. Tiempo total de ejecución es de 45 min.

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Resultados

Un cromatograma típico que se obtiene a través de este proceso se muestra en la Figura 1. FAME se separan por tamaño y grado de saturación por la columna de la GC y protocolo utilizado. Ácidos de cadena más cortas de longitud grasos y ácidos grasos saturados (menos dobles enlaces) tienen tiempos de retención más cortos. La columna GC utilizado y el protocolo no tienen la intención de separar isómeros de ácidos grasos (misma longitud de cadena y grado de saturación, pero diferentes posicione...

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Discusión

El método descrito se puede utilizar para determinar el contenido, así como la composición de ácidos grasos totales presentes en la biomasa de microalgas. Ácidos grasos derivados de todas las clases de lípidos, incluyendo el almacenamiento (TAG), así como los lípidos de membrana (fosfolípidos y glicolípidos), se detectan. Todas las longitudes de cadena y grados de saturación de ácidos grasos que están presentes en las microalgas pueden ser detectados y distinguido. El método se basa en la disrupción mecá...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
tripentadecanoin (C15:0 TAG)	Sigma Aldrich	T4257	CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Larodan
Beadbeater	Bertin Technologies	Precellys 24
beadbeater tubes	MP Biomedicals	Lysing matrix E 116914500
GC-FID	Hewlett-Packer	HP6871
GC column	Supelco	Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl	Mettler Toledo	MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000	Mettler Toledo	C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml	VWR	612-1925
glass tubes	VWR	SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000	VWR	SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps	VWR	SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator	VWR	445-2101
Heated Evaporator/Concentrator	Cole-Parmer	YO-28690-25