微細藻類中の脂肪酸含量および組成の分析

要約

機械的な細胞破壊、溶媒ベースの脂質抽出、エステル交換、および定量化およびガスクロマトグラフィーを用いて脂肪酸の同定に基づく微細藻類中の脂肪酸含量および組成の決定のための方法が記載されている。 tripentadecanoin内部標準抽出及び不完全なエステル交換時の損失の可能性を補償するために使用される。

要約

微細藻類中に存在する全脂肪酸含量および組成を決定するための方法が記載されている。脂肪酸は、微細藻類バイオマスの主成分である。これらの脂肪酸は、異なるアシル脂質クラスに存在することができる。それらは輸送燃料、バルク化学品、栄養補助食品（ω-3脂肪酸）、および食料品の製造に使用することができるので、特にトリアシルグリセロール（TAG）中に存在する脂肪酸は、商業的関心がある。商業的なアプリケーションを開発するには、脂肪酸含量および組成物の定量のための信頼性のある分析方法が必要とされている。微細藻類は、剛性の細胞壁で囲まれた単一細胞である。脂肪酸分析法はすべて、アシル脂質および使用される抽出手順は、すべてのアシル脂質クラスを抽出することができる必要が遊離させるのに十分な細胞破壊を提供すべきである。

ここで紹介する方法では微細藻類中に存在するすべての脂肪酸は、正確かつ再現性のiDENすることができますtifiedおよびそれらが一部である試料の少量（5mg）を、それらの鎖長とは無関係に、不飽和度、又は脂質クラスを使用して定量した。

この方法は、異なる脂質クラスの相対量に関する情報を提供しないが、互いに脂質クラスを分離するために拡張することができる。

この方法は、機械的細胞破壊、溶媒ベースの脂質抽出、脂肪酸メチルエステル（FAME）への脂肪酸のエステル交換、および定量化およびガスクロマトグラフィー（GC-FID）を用いて、脂肪酸メチルエステルの同定配列に基づいている。 TAG内部標準（tripentadecanoin）を抽出し、不完全なエステル交換時の損失を補正するために、分析手順の前に添加される。

概要

脂肪酸は、微細藻類バイオマスの主要構成成分の一つであり、典型的には細胞乾燥重量^1〜3 5〜50％の間を構成する。彼らは主にグリセロ脂質の形で存在する。順番にこれらのグリセロ脂質は、主にリン脂質、糖脂質、およびトリアシルグリセロール（TAG）で構成されています。それらは輸送燃料、バルク化学品、栄養補助食品（ω-3脂肪酸）、および食料品^3-6の製造のための資源として使用することができるため、特にTAGに存在する脂肪酸は、商業的関心がある。微細藻類は、海水基づく培養培地中で増殖することができる陸生植物よりもはるかに高い面積生産性を有することができ、おそらくはオフショア、農業に適していない箇所にフォトバイオリアクターで培養することができる。これらの理由のために、微細藻類は、多くの場合、バイオディーゼルおよび他のバルク生成物^3-6の製造のための陸生植物に対する有望な代替手段と考えられている。潜在的に何農業リットルません及び又は新鮮な水を（閉鎖フォトバイオリアクターで培養または海洋微細藻類が使用されるときの場合）、それらの製造のために必要とされる。そのため、微細藻類由来し、バイオ燃料は、 ^第 3世代のバイオ燃料と考えられている。

脂肪酸（乾燥重量％）、脂質クラス組成物、ならびに脂肪酸の長さおよび飽和度の合計含有量は、微細藻類の細胞種間で高度に可変である。さらに、これらの特性は、栄養素利用性、温度、pH、光強度^1,2培養条件によって変化する。窒素飢餓にさらされたときに、例えば、微細藻類はTAGを大量に蓄積することができる。最適な増殖条件下TAGは、典型的には、乾燥重量の2％未満を構成するが、窒素飢餓TAG含有量にさらされたときに、微細藻類の乾燥重量¹の最大40％まで増加させることができる。

微細藻類は、主に16および18の鎖長を有する脂肪酸を生産炭素原子が、いくつかの種は、最大24個の炭素原子の脂肪酸を作ることができる。高度不飽和脂肪酸は、微細藻類により産生されるように両方、ならびに飽和。 6（ドコサヘキサエン酸、DHA）は野菜の選択肢が^1,2,4,7の存在しないいる。し、C22 5（EPAエイコサペンタエン酸）：後者はC20のような栄養の利点（ω-3脂肪酸）との脂肪酸が含まれる。脂肪酸鎖長および飽和度（分布）は、藻類由来のバイオ燃料および食用油^、4,8の特性および品質を決定する。

微細藻類由来の脂肪酸の商業的なアプリケーションを開発するには、脂肪酸含量および組成物の定量のための信頼性のある分析方法が必要とされている。

またRyckebosch らにより指摘された^。9、微細藻類中の脂肪酸の分析は、他の基質（ 例えば、植物油、食品、動物組織など）と一線を画したようである原因1）微細藻類脂質抽出を複雑化、剛性の細胞壁で囲まれた単一細胞であり、2）微細藻類は、脂質クラスは、多種多様を含み、脂質クラスの分布は⁷非常に可変である。これらの異なる脂質クラスは、以下の化学構造および極性等の特性が多種多様を有する。また、アシル脂質以外の脂質クラスが生成される、3）微細藻類は、長さが12〜24個の炭素原子の範囲および飽和並びに高度不飽和脂肪酸の両方を含む、脂肪酸の多種多様を含む。従って、微細藻類以外の基板に脂肪酸を分析するために開発された方法は、微細藻類中の脂肪酸を分析するのに適しないかもしれない。

Ryckebosch ら ⁹によって検討したように、一般に使用される脂質抽出手順の主な違いは、使用される溶媒系である。そのため微細藻類に存在する脂質クラスの大規模な様々な、それぞれの極性が異なる、抽出された脂質量は^{、10月12日}に使用溶媒によって変化します。これは文献^9,10に示した脂質含量および組成が矛盾につながる。使用する溶媒系、例えば、ビーズビーティングまたは超音波処理を通じて細胞破壊することなく、溶媒抽出に基づく方法に応じて、いくつかの理由微細藻類種^9,13の剛構造の全ての脂質を抽出しない場合があります。不完全な脂質抽出の場合には、異なる脂質クラスの抽出効率が^14を変化させることができる。脂肪酸組成は、脂質クラス⁷の間で可変であるので、これはまた、測定された脂肪酸組成に影響を及ぼし得る。

我々の方法は、機械的細胞破壊、溶媒ベースの脂質抽出、脂肪酸メチルエステル（FAME）への脂肪酸のエステル交換、および定量化及び難ionizaと組み合わせたガスクロマトグラフィーを用いて脂肪酸メチルエステルの同定配列に基づいているTiONから検出器（GC-FID）。トリアシルグリセロール（tripentadecanoin）の形で内部標準を前に分析手順に追加されます。抽出と不完全なエステル交換中の注意損失はその後のために補正することが可能となる。この方法は、コンテンツだけでなく、微細藻類バイオマス中に存在する脂肪酸の​​組成を決定するために使用することができる。ストレージ（TAG）並びに膜脂質（糖脂質、リン脂質）を含む異なるアシル - 脂質クラスに存在する全ての脂肪酸は、検出、同定し、試料のごく少量（5 mg）を使用して、この方法により、正確かつ再現可能に定量する。この方法は、異なる脂質クラスの相対量に関する情報を提供していません。しかしながら、この方法は、互いに¹から^の脂質クラスを分離するために拡張することができる。異なる脂質クラスの濃度および脂肪酸組成物は、次いで、個別に決定することができる。

文献に他のいくつかの方法があります微細藻類中の脂質を分析するために記載。他の方法は、全脂肪酸^9,16に焦点を当て、一方、いくつかの方法は、親油性成分の総¹⁵に焦点を当てる。これらの選択肢は、総抽出した脂質の重量測定、クロマトグラフィーを用いて定量化と組み合わせた脂肪酸の直接エステル交換、及び親油性の蛍光色素で染色した細胞が含まれています。

クロマトグラフィーを用いて脂肪酸の定量に一般的に使用される代替案は、重量測定^17,18を用いた脂質の定量化である。なぜなら、標準化された分析装置（ 例えばソックスレー）の利用可能性、プロシージャを設定するために緩和する。、重量測定の利点としては、ガスクロマトグラフなどの高度で高価な装置のための必要条件の欠如であり、重量測定は、より少ない時間のかかるよりもクロマトグラフィーに基づく方法。 OTHのクロマトグラフィーに基づく方法を使用することの主な利点小胞体の手がこのような方法では脂肪酸のみを測定することである。重量測定中の脂質を含有する非脂肪酸は、顔料またはステロイドのように、また決定に含まれている。これらの非脂肪酸含有脂質は総脂質の大部分（> 50％）を構成することができます。一つは（バイオディーゼル用途のためなど）、脂肪酸含量のみに関心がある場合、重量測定を用いた場合には、過大評価されるであろう。また、重量測定で抽出された脂質を計量するために使用される化学天秤の精度を使用する必要があるサンプルサイズを決定する。この量は、典型的にはクロマトグラフィーを用いた場合に必要な量よりもはるかに多くなる。最後に、重量測定でのクロマトグラフィーを使用することの別の利点は、クロマトグラフィーは、脂肪酸組成に関する情報を提供することである。

私たちの提示方法を別の方法としては、直接のエステル交換^16,19,20です。この方法でのFAMEへの脂質抽出と脂肪酸のエステル交換は、1つの工程で合成される。このメソッドは、別の抽出とエステル交換ステップよりも迅速であるが、これらのステップを組み合わせて抽出に用いることができる溶媒が制限されます。これは、負に抽出効率に影響を与える可能性がある。別個の脂質抽出およびエステル交換工程の別の利点は、これらのステップ¹との間に追加の脂質クラスの分離を可能にすることである。直接エステル交換反応を使用した場合、これは不可能である。

微細藻類の脂質含量を決定するためのその他の一般的に使用される方法は、ナイルなどの親油性の蛍光染色剤で染色バイオマスを含む赤色またはBODIPY蛍光シグナル^を測定する^21,22。これらの方法の利点は、それらが別の方法よりも面倒であることである。これらの方法の欠点は、蛍光応答は、様々な理由のために、仕様の間で可変であることであるES、栽培条件、脂質クラス、および分析手順。一例として、これらの変化のいくつかは、微細藻類による色素の取り込みの差によって引き起こされる。別の定量法を用いたキャリブレーションは、したがって、好ましくは、すべての異なる栽培条件や成長段階に行わ、必要とされている。最後に、この方法は、脂肪酸組成についての情報を提供し、クロマトグラフィーに基づく方法よりも正確かつ再現可能ではありません。

提示された方法は、Lamers ら ²³及びサントスら ²⁴によって記載された方法に基づいており、また、様々な他の著者^1,25-27によって適用されてきた。他の方法は、同じ原理に基づいてその利用可能であり、同様の結果^を提供すること^ができる^9,28。

プロトコル

1。試料調製

1.1および1.2のステップとして、サンプル調製のための代替プロトコルが含まれる2つがあります。どちらの方法も同様に適しており、同様の結果を与えるが、藻類培養容量の限られた量が利用可能な場合は、この方法1.1が推奨されます。

NOTE：プロトコルのいずれかは、全体のプロトコルに従ってつの追加ビーズビーターチューブを調製、ブランクとして使用するためにそれらに藻類を追加せず。このように、使用される材料からの成分の抽出から得られたGCクロマトグラムのピークを同定し、定量することができる。

1.1。藻類培養の限られた量が利用可能な場合に推奨：準備プロトコルオプション1のサンプル

1. ブロイヤーらによって記載されているように、たとえば、培養液中に藻の乾燥重量濃度（g / Lの）を決定します^。1。
2. 5〜10 mgの藻の乾燥重量が含まれている培養液の量を転送ガラス遠心管。ステップ1.1.1で決定したバイオマス濃度を使用して転送バイオマスの正確な量を計算します。
3. 1,200×gで5分間遠心。
4. 上清の一部を破棄し、チューブ内を約0.25ミリリットルのままにしておきます。
5. で、残りの上清中の藻を中断再優しく上下にペレットをピペットで200μlのピペットを用いてビーズビーターチューブに完全な細胞ペレットを転送します。
6. ±0.15ミリリットルミリQ水で遠心チューブとガラスピペットを洗浄し、同じビーズビーターチューブに液体を移す。
7. 遠心分離機は、気泡がチューブの底に残っていないことを確認するために、最大回転数で1分間ビーターチューブビーズ。それは-80℃で密閉ビーズビーターチューブを記憶することが可能である
8. 試料を含有するビーズビーターチューブを凍結乾燥。それは-80℃で密閉ビーズビーターチューブを記憶することが可能である

1.2。サンプル調製プロトコルオプション2

1. 藻類培養液の不確定量を遠心分離し、上澄みを捨てる。なお、バイオマス濃度を決定するために使用されるか、体積を測定する必要はない。
2. 培養培地中に存在する主な塩の濃度を用いて培養培地の浸透圧を測定又は計算する。
3. 培養培地の浸透圧に近似ギ酸アンモニウム溶液から、ステップ1.2.1において使用されるように、同じ体積で細胞ペレットを再懸濁することにより細胞ペレットを洗浄する。 equiosmolarギ酸アンモニウム溶液は、細胞の洗浄中に細胞が溶解を防ぐことができます。

NOTE：細胞を洗浄する培養培地中に存在する塩を除去する必要がある。これは、それらの培養培地中の高塩濃度の海洋微細藻類中の脂肪酸分析のために特に重要である。塩が依然として存在することになる場合、これは後述のtで決定される細胞乾燥重量の量の過大評価を引き起こす彼のプロトコル。ギ酸アンモニウムは、この解決策は完全に凍結乾燥中に蒸発し、残留物を残さないので、細胞を洗浄するために使用されます。

4. 遠心藻懸濁液および廃棄上清。
5. 細胞ペレットを凍結乾燥。
6. ビーズビーターチューブに5〜10mgの凍結乾燥した微細藻類の粉末を秤量する。正確な重量を記録します。

2。細胞を破砕した脂質抽出

注：このセクションでは、広範な細胞破壊手順について説明します。おそらく、細胞破壊ステップのいくつかは冗長であり、あまり大規模な細胞破壊は、いくつかの微細藻類種または特定の培養条件に由来し、バイオマスも同じ結果が得られるかもしれません。しかし、これはそれぞれの特定の状況の検証が必要になります。そこで提案された大規模な混乱プロトコルは、すべての微細藻類材料に適した普遍的な方法として推奨されている。

1. tripentadecanoinの正確な量を計量（TR3 C15含むiacylglycerol：0脂肪酸を）、それは4時05分（V / V）のクロロホルムを正確に知られている量に追加する：メタノール。このようにしてtripentadecanoinの濃度が正確に知られている。 50ミリグラム/ Lの濃度を目指すTripentadecanoinは、脂肪酸定量のための内部標準として機能する。
2. 追加1ミリリットルのクロロホルム：メタノール4時05分（V / V）（試薬や機器の表で指定された）それぞれの鼓動チューブにtripentadecanoinを含む。ビードビーターチューブのキャップ内に残った何ビーズがないことを確認し、これはチューブの漏れが発生します。溶剤の正確な添加のための容積式ピペットを使用してください。
3. ビーズは、ビーズビーター管は各鼓動間の内部120秒で、60秒間2,500 rpmで毎回8倍破った。
4. テフロンインサートスクリューキャップできれいな耐熱15ミリリットルガラス遠心管にビーズビーターチューブから溶液を移す。だけでなく、ビーズビーターチューブから全てのビーズを転送するようにしてください。
5. されていましたHビーズビーターチューブ、追加1ミリリットルのクロロホルム：メタノール4時05分（V / V）ビーズビーターチューブ、近いキャップと混合し、ステップ2.4​​から同一のガラス管に、このソリューションを転送するにtripentadecanoin含む。 （クロロホルム、合計4ミリリットル中：メタノール4時05分（V / V）を含むtripentadecanoinがサンプルごとに使用されている - 3回の洗浄工程のためのステップ2.2および3ミリリットルで追加1ミリリットル）のチューブを3回洗浄します。
6. 10分間の超音波処理浴中で5秒間超音波処理用ガラスチューブをボルテックスする。
7. 50 mMの2 - アミノ-2 - ヒドロキシメチル - プロパン-1,3 - ジオール（トリス）およびHCl溶液を用いてpHを7に設定されている1 MのNaClを含有する、ミリQ水2.5mlを添加する。水：これはクロロホルムとメタノールの相分離の原因となります。 1 MのNaClを、クロロホルム相に向かって脂質の平衡を向上させるために使用される。
8. 5秒間ボルテックスした後、10分間超音波処理。
9. 1,200×gで5分間遠心分離します。
10. ガラスパスツールpipettを使用して清浄なガラス管に全体クロロホルム相（下相）を転送E。任意の中間相または上相を転送しないように注意してください。
11. 再抽出（メタノール含有する：水の溶液）を古いチューブに1mLのクロロホルムを添加して試料を。
12. 5秒間ボルテックスした後、10分間超音波処理。
13. 1,200×gで5分間遠心分離します。
14. ステップ2.10からの最初のクロロホルム画のガラスパスツールピペットやプールを使用してクロロホルム相（下相）を収集。
15. 難しさは前のステップで全体のクロロホルム画分を収集する経験がある場合、繰り返して、2.11から2.14を繰り返します。そうでない場合はステップ2.16に進みます。
16. 窒素ガス気流中でチューブからクロロホルムを蒸発させる。このステップの後、試料を窒素ガス雰囲気下、-20℃で保存することができる。

3。脂肪酸メチルエステルへのエステル交換

1. 乾燥した抽出した脂質（もともとクロロホルム画分を含むチューブ）を含むチューブに5％を含有するメタノール3ml（v / v）の硫酸を添加し、しっかりとチューブを閉じます。
2. 5秒間ボルテックスする。
3. ブロックヒーター又は水浴中で70°Cで3時間、サンプルをインキュベートする。定期的（30分ごとに±）のサンプルが沸騰（不適切に閉じられた蓋によって引き起こされる）と、渦管されていないことを確認してください。この反応中に脂肪酸は、それらの脂肪酸メチルエステル（FAME）にメチル化されている。
4. クールなサンプル室温にし、3ミリリットルミリQ水と3ミリリットルのn-ヘキサンを加える。
5. 5秒間ボルテックスし、試験管回転装置で15分間混合する。
6. 1,200×gで5分間遠心分離します。
7. ヘキサンの2ミリリットル（上）相を収集し、ガラスパスツールピペットを用いて、新鮮なガラス管に入れた。
8. それを洗浄するために収集したヘキサン相に2ミリリットルミリQ水を加える。
9. 1,200×gで5分間の5秒、遠心ボルテックス。このステップの後、窒素ガス雰囲気（相分離の必要がない）下で-20℃でサンプルを記憶することができる。

4。脂肪酸メチルエステルのUの定量化ガスクロマトグラフィーを歌う

1. ガラスパスツールピペットを用いてヘキサン相（上相）でのGCバイアルを埋める。
2. GCバイアルにキャップを置きます。バイアルからの蒸発を防ぐため、キャップが完全に密封されており、オンにすることはできませんことを確認してください。
3. GCの洗浄溶媒（ヘキサン）補充、廃棄物のバイアルを空にし、オートサンプラーにサンプルバイアルを置きます。 GCの上の実際のサンプルを実行する前に、最初の実行のGCにのみ、ヘキサンを含む2のブランク。
4. Nukolカラム（×1.0〜30μmのMX 0.53ミリメートル）で、GC-FIDでサンプルを実行します。 250℃の入口温度を使用し、キャリアガス、81.7キロパスカルの圧力および0.1:1のスプリット比、総流量としてヘリウムを使用する：20 ml /分。 40ml /分のH ₂流量400 ml /分の空気流量とHe 9.3 ml /分の流速で270°CのFID検出器温度。 1μL/サンプルに注入量を設定します。 n-ヘキサンで前後の洗浄インジェクター。初期オーブン温度は0.5分間90℃に設定した後、ウィットを提起している時間、20°C /分で200°Cのオーブン温度に達するまで。オーブン温度を次に39分間200℃に維持される。総実行時間は45分である。

結果

このプロセスを介して得られる典型的なクロマトグラムを図1に示す。 FAMEを用いるGCカラムおよびプロトコルによって、彩度の大きさ及び程度によって分離されている。短い鎖長脂肪酸およびそれ以上の飽和脂肪酸（より少ない二重結合）より短い保持時間を有する。使用されるGCカラムおよびプロトコルは、脂肪酸異性体（同じ鎖長および飽和度が、二重結合の位置が異なる）?...

ディスカッション

記載された方法は、コンテンツだけでなく、微細藻類バイオマス中に存在する全脂肪酸の組成を決定するために使用することができる。ストレージ（TAG）並びに膜脂質（リン脂質および糖脂質）を含むすべての脂質クラス由来の脂肪酸が検出される。微細藻類中に存在する全ての飽和脂肪酸鎖長および程度を検出し、区別することができる。この方法は、機械的細胞破壊、溶媒ベースの脂質?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent and equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
tripentadecanoin (C15:0 TAG)	Sigma Aldrich	T4257	CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Larodan
Beadbeater	Bertin Technologies	Precellys 24
beadbeater tubes	MP Biomedicals	Lysing matrix E 116914500
GC-FID	Hewlett-Packer	HP6871
GC column	Supelco	Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl	Mettler Toledo	MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000	Mettler Toledo	C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml	VWR	612-1925
glass tubes	VWR	SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000	VWR	SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps	VWR	SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator	VWR	445-2101
Heated Evaporator/Concentrator	Cole-Parmer	YO-28690-25