Анализ жирных кислот содержание и состав микроводорослей

Резюме

Способ определения содержания жирных кислот и состава микроводорослей на основе механического разрушения клеток, на основе экстракции липидов растворителем, переэтерификации и количественного и идентификации жирных кислот с использованием газовой хроматографии описано. Tripentadecanoin внутренний стандарт используется для компенсации возможных потерь при добыче и неполной переэтерификации.

Аннотация

Способ для определения содержания и состава общего количества жирных кислот, присутствующих в микроводорослей описывается. Жирные кислоты являются основным компонентом микроводорослей биомассы. Эти жирные кислоты могут присутствовать в различных ацил-липидной классов. Особенно жирные кислоты, присутствующие в триацилглицерина (TAG) имеют коммерческий интерес, потому что они могут быть использованы для производства транспортного топлива, сыпучих химических веществ, биологически активные добавки (ω-3 жирных кислот), а также продовольственных товаров. Чтобы разрабатывать коммерческие приложения, надежные аналитические методы для количественного определения содержания кислоты жирного и состава необходимы. Микроводорослей одиночные клетки, окруженные жесткой клеточной стенки. Метод анализа жирных кислот должно обеспечить нарушение достаточное клеток, чтобы освободить все ацильные липиды и процедуры экстракции используется должны быть в состоянии извлечь все классы ацил липидные.

С метод, представленный здесь все жирные кислоты, присутствующие в микроводорослей можно точно и воспроизводимо тождающиеся и количественно, используя небольшое количество образца (5 мг) независимо от их длины цепи, степени ненасыщенности или класса липидов они являются частью.

Этот метод не дает информации о относительного обилия различных классов липидов, но может быть продлен, чтобы отделить классы липидов друг от друга.

Метод основан на последовательности механическое разрушение клеток, экстракции липидов на основе растворителя, переэтерификацией жирных кислот в метиловых эфиров жирных кислот (Fames), а также количества и идентификации МЭЖК с использованием газовой хроматографии (GC-FID). TAG внутренний стандарт (tripentadecanoin) добавляется до аналитической процедуры для коррекции потерь при добыче и неполной переэтерификации.

Введение

Жирные кислоты являются одним из основных компонентов микроводорослей биомассы и обычно составляют от 5-50% клеточной сухого веса ^1-3. Они в основном присутствуют в виде глицеролипидов. Эти глицеролипиды, в свою очередь состоят в основном из фосфолипидов, гликолипидов и триглицеридов (TAG). Особенно жирные кислоты, присутствующие в TAG имеют коммерческий интерес, потому что они могут быть использованы в качестве ресурса для производства транспортного топлива, сыпучих химических веществ, биологически активные добавки (ω-3 жирных кислот), а также продовольственных товаров ^3-6. Микроводорослей может расти в морской воде на основе выращивания СМИ, может иметь гораздо более высокую поверхностную производительность, чем наземных растений, и могут быть выращены в фотобиореакторов в местах, непригодных для сельского хозяйства, возможно, даже в море. По этим причинам, микроводоросли часто считают перспективной альтернативой наземных растений для производства биодизеля и других сыпучих продуктов ^3-6. не Потенциально не сельскохозяйственного ли или пресная вода (при культивировании в закрытых фотобиореакторов или когда морские водоросли используются) необходим для их производства. Таким образом, биотопливо, полученные из микроводорослей считаются 3 биотопливо ^й поколения.

Общий клеточный содержание жирных кислот (% от сухого веса), состав класса липидов, а также длины жирных кислот и степени насыщения сильно варьируют между микроводорослей видов. Кроме того, эти свойства меняются в зависимости от условий культивирования, такие как наличие питательных веществ, температуры, рН и интенсивности света ^1,2. Например, при воздействии азотного голодания, микроводоросли могут накапливаться в больших количествах TAG. При оптимальных условиях роста TAG обычно составляет менее 2% от сухого веса, но при контакте с азотного голодания содержания TAG может увеличиться до до 40% от микроводорослей сухого веса ^1.

Микроводорослей в основном производят жирные кислоты с длиной цепи от 16 до 18атомы углерода, но некоторые виды могут сделать жирных кислот вплоть до 24 атомов углерода в длину. Оба насыщенный а также ненасыщенных жирных кислот получают путем микроводорослей. К последним относятся жирные кислоты с питательной ценности (ω-3 жирных кислот), как С20: 5 (эйкозапентаеновая кислота; ЭПК) и С22: 6 (докозагексаеновая кислота; DHA), для которых нет растительные альтернативы не существуют ^1,2,4,7. (Распределение) жировой длины цепи кислоты и степени насыщения также определяет свойства и качества водорослей, полученных биотоплива и пищевыми маслами ^4,8.

Для разработки коммерческих приложений микроводорослей происходит жирных кислот, надежные аналитические методы для количественного определения содержания кислоты жирного и состава необходимы.

Кроме того, как указал Ryckebosch др.. ^9, анализ жирных кислот в микроводорослей отличается от других субстратов (например, растительное масло, продукты питания, ткани животных и т.д.) бытьвызвать 1) микроводорослей одиночные клетки, окруженные жесткими стенками клеток, что затрудняет экстракции липидов, 2) микроводоросли содержат широкий спектр классов липидов и распределение липидов класс сильно варьирует ^7. Эти различные классы липидов имеют широкий спектр по химической структуре и свойствам, таким как полярности. Кроме того, липидные классы, кроме ацильных липидов производятся; 3) микроводоросли содержат широкий спектр жирных кислот, в пределах от 12-24 атомов углерода в длину и содержит как насыщенные, так и ненасыщенных жирных кислот. Таким образом, методы, разработанные для анализа жирных кислот в других, чем микроводорослей субстратов, могут не подходить для анализа жирных кислот в микроводорослей.

Как показали в Ryckebosch др.. ^9, основное различие между наиболее часто используемых процедур экстракции липидов в растворителя-систем, которые используются. Из-за большого разнообразия липидных классов, присутствующих в микроводорослей, каждый разной полярности, извлеченныйколичество липидов будет варьировать в зависимости растворителей, используемых ^10-12. Это приводит к несогласованности в содержании липидов и композиции, представленные в литературе ^9,10. В зависимости от системы используемого растворителя, методы, основанные на экстракции растворителем без разрушения клеток через, например, шарик избиение или ультразвуком, не могли бы извлечь все липиды из-за жесткой конструкции некоторых видов микроводорослей ^9,13. В случае неполного экстракции липидов, эффективность экстракции из различных классов липидов может изменяться ^14. Это также может оказывать влияние на измеренного состава жирных кислот, так как состав жирных кислот является переменной между липидными классов ^7.

Наша методика основана на последовательности механическое разрушение клеток, экстракции липидов на основе растворителя, переэтерификацией жирных кислот в метиловых эфиров жирных кислот (Fames), а также количества и идентификации МЭЖК с использованием газовой хроматографии в сочетании с ионизации пламениДетектор уравнение (GC-FID). Внутреннего стандарта в виде триглицеридов (tripentadecanoin) добавляют до аналитической процедуры. Возможные потери при добыче и неполного переэтерификации затем могут быть исправлены в течение. Метод может быть использован для определения содержания а также состав жирных кислот, присутствующих в микроводорослей биомассы. Все жирные кислоты, присутствующие в различных ацил-липидной классов, включая хранение (TAG), а также мембранные липиды (фосфолипиды, гликолипиды), которые обнаружены, определенные и количественно точно и воспроизводимо этим методом, используя только небольшое количество образца (5 мг) . Этот метод не дает информации о относительного обилия различных классов липидов. Однако метод может быть расширен, чтобы отделить классы липидов друг от друга ^1. Состав концентрация кислоты и жирных из различных классов липидов может быть определена индивидуально.

В литературе несколько другие методыописано для анализа липидов в микроводорослей. Некоторые методы сосредоточиться на общих липофильных компонентов ^15, в то время как другие методы сосредоточиться на общего количества жирных кислот ^9,16. Эти альтернативы включают весового определения общего извлеченных липидов, прямой транс-этерификации жирных кислот в сочетании с количественной использованием хроматографии, и окрашивания клеток с липофильных красителей люминесцентных.

Обычно используется альтернатива количественной оценки жирных кислот с использованием хроматографии является количественная оценка липидов с помощью весового определения ^17,18. Преимущества весового определения являются отсутствие требований к передовой и дорогостоящего оборудования, как газовый хроматограф; облегчить настроить процедуру, из-за наличия стандартизированного аналитического оборудования (например Сокслета) и гравиметрические определения меньше времени, чем хроматографии на основе методов. Основное преимущество использования хроматографию, основанную на методы др.ER рука является то, что в таком способе измеряют только жирные кислоты. В весовом определении не-жирной кислоты, содержащий липиды, как пигменты или стероидов, также учитывается при определении. Эти не жирных кислот, содержащие липиды могут составить значительную долю (> 50%) общих липидов. Если заинтересован только в содержания жирных кислот (например, для применения биодизеля), он будет переоценить при использовании гравиметрических определение. Кроме того, в весовом определении точность аналитических весах используются для взвешивания извлеченные липиды определяет размер выборки, которая должна быть использована. Эта величина обычно значительно больше, чем количество, необходимое при использовании хроматографии. И, наконец, еще одно преимущество с помощью хроматографии на весового определения является то, что хроматографии дает информацию о составе жирных кислот.

Еще одной альтернативой нашей предложенного метода является прямым переэтерификации ^16,19,20.В этом методе экстракции липидов и переэтерификации жирных кислот в МЭЖК объединены в одну стадию. Этот способ быстрее, чем отдельный экстракции и переэтерификации шаг, но сочетания этих шагов ограничивает растворители, которые могут быть использованы для извлечения. Это может негативно повлиять эффективность экстракции. Еще одним преимуществом отдельного экстракции липидов и переэтерификации стадии, что она позволяет для дополнительного разделения класса липидов между этими шагами ^1. Это невозможно при использовании прямой переэтерификации.

Другие часто используемые методы для определения содержания липидов в микроводорослей включают окрашивания биомассы с липофильных флуоресцентных красителей, таких как Нил красный или BODIPY и измерения сигнала флуоресценции ^21,22. Преимуществом этих методов является то, что они менее трудоемкий, чем альтернативные методы. Недостатком этих методов является то, что флуоресцентный ответ, по разным причинам, переменная между SPECIэс, условия культивирования, классы липидов и аналитические процедуры. В качестве примера, некоторые из этих изменений обусловлены различия в поглощения красителя в микроводорослей. Калибровка с помощью другого количественный метод Поэтому необходимо, предпочтительно выполняется для всех различных условий культивирования и стадий роста. Наконец, этот метод не дает информации о составе жирных кислот и является менее точным и воспроизводимым, чем хроматографии на основе методов.

Представленный способ основан на методике, описанной Lamers соавт. ²³ и Santos соавт. ²⁴ и также применяется в различных других авторов ^1,25-27. Существуют и другие методы доступны, которые основаны на тех же принципах и может обеспечить аналогичные результаты ^9,28.

протокол

1. Подготовка образцов

Есть два альтернативных протоколов для пробоподготовки включены как шаги 1.1 и 1.2. Оба метода одинаково хорошо подходят и дают близкие результаты, но если ограниченное количество объема культуры водорослей имеется, метод 1.1 рекомендуется.

Примечание: В любом протокола, подготовить две дополнительные шарик било труб по всей протокола но без добавления к ним водоросли, которые будут использоваться в качестве бланка. Таким образом, пики в GC хроматограмме в результате экстракции компонентов из материалов, используемых могут быть идентифицированы и количественно.

1.1. Подготовка проб Протокол Вариант 1: Рекомендуемая Когда ограниченное количество водорослей культуры доступно

1. Определить концентрацию водорослей сухой вес (г / л) в культуральном бульоне, например, как описано Breuer и соавт. ^1.
2. Передача объем культуральной жидкости, содержащий 5-10 мг сухого веса водоросли, чтобыстакан центрифуги трубки. Рассчитать точное количество биомассы, переведенные с помощью концентрации биомассы, определенной на этапе 1.1.1.
3. Центрифуга 5 мин при 1200 х г.
4. Отменить часть надосадочной жидкости, оставьте примерно 0,25 мл в трубке.
5. Повторное приостановить водоросли в остальной супернатанта, осторожно пипеткой осадок вверх и вниз и передавать полный осадок клеток в шаровой колотушки трубки с помощью 200 мкл пипетки.
6. Промыть центрифужную пробирку и стеклянную пипетку с ± 0,15 мл MilliQ воды и передавать жидкость к тому же борта колотушки трубки.
7. Центрифуга шарик ударные трубки для одной минуты при максимальных оборотах, чтобы убедиться, что не пузырьки воздуха остаются в нижней части трубок. Можно хранить закрытые шарик било труб при температуре -80 ° С.
8. Лиофилизацией шарик било пробирки, содержащие образец. Можно хранить закрытые шарик било труб при температуре -80 ° С.

1.2. Подготовка образцов Протокол Вариант 2

1. Центрифуга неопределенный объем водоросли культуральной жидкости и отбросить супернатант. Это не является необходимым для определения концентрации биомассы или для измерения объема используется.
2. Измерить или рассчитать осмолярность культуральной среды с использованием концентрации основных солей, присутствующих в культуральной среде.
3. Промыть осадок клеток путем ресуспендирования осадок клеток в том же объеме, как используемый на стадии 1.2.1 из формиата аммония, что приблизительно соответствует осмолярности культуральной среды. Equiosmolar раствор формиата аммония предотвращает клеточные лизирует во врем промывки клеток.

Примечание: промывки клеток необходимо удалить соли, присутствующих в культуральной среде. Это особенно важно для анализа жирных кислот в морских микроводорослей из-за высоких концентрациях соли в их культуральную среду. Если соли все равно будет присутствовать, это привело бы к завышению суммы клеток сухой массы, которая будет определяться позже в тего протокол. Формиат аммония используется для мыть клетки, потому что это решение будет полностью испариться во время лиофилизации и не оставляет никаких остатков.

4. Центрифуга водоросли подвеска и отбросить супернатант.
5. Лиофилизуют осадок клеток.
6. Взвесьте 5-10 мг лиофилизированного микроводорослей порошок в шаровой колотушки трубки. Запишите точный вес.

2. Разрушение клеток и Добыча липидов

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описываются обширный процедуру разрушения клеток. Возможно, некоторые из шагов, разрушения клеток являются избыточными и менее обширные разрушение клеток может дать те же результаты для некоторых видов микроводорослей или для биомассы, полученной из определенных условиях культивирования. Для этого потребуется проверки для каждой конкретной ситуации, однако. Поэтому предлагаемая обширная протокол нарушения рекомендуется в качестве универсального метода, пригодного для всех микроводорослей материала.

1. Взвесьте точное количество tripentadecanoin (TRiacylglycerol, содержащий три C15: 0 жирных кислот) и добавить его к точно известного количества 4:05 (об / об) хлороформ: метанол. Таким образом, концентрация tripentadecanoin точно известно. Цель для концентрации 50 мг / л Tripentadecanoin служит в качестве внутреннего стандарта для количественного жирных кислот.
2. Добавить 1 мл хлороформ: метанол 4:5 (объем / объем), содержащий tripentadecanoin в каждой трубке (размола, указанного в таблице реагентов и оборудование). Убедитесь, что нет никаких бусины остальные внутри крышки от beadbeater трубки, это приведет к утечке из трубок. Используйте положительное пипетки смещения для точного добавлением растворителей.
3. Бусы бить шарик ударные трубки 8x на 2500 оборотов в минуту в течение 60 секунд, каждый раз с 120 с внутренней между каждым избиения.
4. Переносят раствор из шарик ударными трубками в чистую термостойкого стекла 15 мл центрифужную пробирку с тефлоновой вставкой винтовыми крышками. Будьте уверены, чтобы передать все бусинки от бортового колотушки трубки, а также.
5. Чтобы былоч шарик било трубки, добавляют 1 мл хлороформ: метанол 4:5 (объем / объем), содержащий tripentadecanoin в бисерной колотушки трубки, недалеко крышкой и смешивать, и передать это решение одной и той же стеклянной трубки с шагом 2,4. Промыть трубки три раза (в общей сложности 4 мл хлороформа и метанола 4:5 (объем / объем), содержащий tripentadecanoin на образец используют - 1 мл добавляют на стадии 2,2 и 3 мл в течение 3 стадий промывки).
6. Вихревые стеклянные пробирки в течение 5 секунд и ультразвуком в ультразвуковой обработки бане в течение 10 мин.
7. Добавить 2,5 мл MilliQ воде, содержащем 50 мМ 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1 ,3-диол (Трис) и 1 М NaCl, который установлен до рН 7 с помощью раствора HCl. Это приведет к фазовое разделение между хлороформом и метанол: вода. 1 М NaCl используется для повышения равновесие липидов по отношению к фазе хлороформ.
8. Vortex в течение 5 секунд, а затем разрушать ультразвуком в течение 10 мин.
9. Центрифуга течение 5 мин при 1200 х г.
10. Перенесите всю фазу хлороформ (нижняя фаза) к чистой стеклянной трубки с использованием стекла Пастера pipettэ. Убедитесь в том, не передавать никакую интерфазу или верхнюю фазу.
11. Повторно извлечения образца добавлением 1 мл хлороформа к старой трубы (содержащий метанол: водный раствор).
12. Vortex в течение 5 секунд, а затем разрушать ультразвуком в течение 10 мин.
13. Центрифуга течение 5 мин при 1200 х г.
14. Соберите фазу хлороформ (нижняя фаза) с использованием стекла пипетки Пастера и бассейн с первой хлороформ фракции со стадии 2.10.
15. Если трудности испытывают в сборе весь фракцию хлороформа в предыдущем шаге, повторите шаги 2.11-2.14. В противном случае перейдите к шагу 2.16.
16. Упаривают хлороформ из трубки в потоке газообразного азота. После этого шага образцы можно хранить при -20 ° С в атмосфере азота.

3. Переэтерификация в метиловые эфиры жирных кислот

1. Добавить 3 мл метанола, содержащего 5% (объем / объем) серной кислоты в пробирку, содержащую высушенные извлеченные липиды (трубка первоначально содержащие хлороформ) и фракциизакрыть трубку плотно.
2. Vortex в течение 5 сек.
3. Инкубируйте образцы в течение 3 часов при 70 ° С в нагревательном блоке или водяной бане. Периодически (каждые ± 30 мин) гарантировать, что образцы не кипящей (вызвано неправильно закрытой крышке) и вихревые трубки. Во время этой реакции жирных кислот, метилированный их метиловых эфиров жирных кислот (Fames).
4. Прохладный образцы до комнатной температуры и добавляют 3 мл MilliQ воды и 3 мл н-гексана.
5. Vortex в течение 5 сек и перемешивать в течение 15 мин с пробиркой ротатора.
6. Центрифуга течение 5 мин при 1200 х г.
7. Соберите 2 мл гексана (верхний) фазу и положить в пресной стеклянной трубки с использованием стекла пипетки Пастера.
8. Добавить 2 мл MilliQ воды в собранной фазе гексан, чтобы вымыть его.
9. Vortex в течение 5 сек и центрифуги в течение 5 мин при 1200 х г. После этого шага можно хранить образцы при -20 ° С в атмосфере газообразного азота (разделения фаз не нужно).

4. Количественная оценка Fames Uпеть газовой хроматографии

1. Заполните GC флаконов с фазой гексан (верхняя фаза) с помощью стекла пипетки Пастера.
2. Наведите колпачки с GC флаконах. Убедитесь, что крышки полностью герметизированы, и не может быть включен, для предотвращения испарения из флакона.
3. Залейте в ГК мытья растворители (гексан) очищайте флаконов отходов, и поставить образцы флаконов в авто-сэмплер. Перед запуском фактические примеры на GC, первого запуска 2 заготовок, содержащие только гексан на GC.
4. Запуск образцов на GC-FID с колонной Nukol (30 м х 0,53 мм х 1,0 мкм). Использование температуру на входе 250 ° С и использовать гелий в качестве газа-носителя, давлении 81,7 кПа и разделенного соотношении 0,1:1, общая скорость потока: 20 мл / мин. FID детектор температура 270 ° С с Н ₂ скорости потока 40 мл / мин, скорости воздушного потока 400 мл / мин и скорость 9,3 мл / мин он течь. Установить объем впрыска до 1 мкл / образец. До и после мытья инжектор с н-гексана. Начальная температура печи установлен на 90 ° С в течение 0,5 мин и затем повышают умч 20 ° C / мин до тех пор температуре печи 200 ° С пока не будет достигнута. Температура термостата затем выдерживают при 200 ° С в течение 39 мин. Общее время выполнения составляет 45 мин.

Результаты

Типичная хроматограмма, который получен с помощью этого процесса показана на рисунке 1. FAMEs разделены по размеру и степени насыщения на колонку для ГХ и используемого протокола. Более короткие длины цепи жирных кислот и более насыщенные жирные кислоты (меньше двойных связей) и?...

Обсуждение

Описанный способ может быть использован, чтобы определить содержание а также состав общего количества жирных кислот, присутствующих в микроводорослей биомассы. Жирные кислоты, полученные из всех классов липидов, включая хранение (TAG), а также мембранные липиды (фосфолипиды и гликолипи...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent and equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
tripentadecanoin (C15:0 TAG)	Sigma Aldrich	T4257	CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Larodan
Beadbeater	Bertin Technologies	Precellys 24
beadbeater tubes	MP Biomedicals	Lysing matrix E 116914500
GC-FID	Hewlett-Packer	HP6871
GC column	Supelco	Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl	Mettler Toledo	MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000	Mettler Toledo	C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml	VWR	612-1925
glass tubes	VWR	SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000	VWR	SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps	VWR	SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator	VWR	445-2101
Heated Evaporator/Concentrator	Cole-Parmer	YO-28690-25