Análise do conteúdo de ácidos graxos e composição em Microalgas

Resumo

Um método para a determinação do teor de ácidos gordos e composição de microalgas baseado em ruptura mecânica da célula, a extracção de lípidos à base de solvente, a transesterificação, e quantificação e identificação de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa é descrito. Uma norma interna tripentadecanoin é usado para compensar as possíveis perdas durante a extração e transesterificação incompleta.

Resumo

Um método para determinar o conteúdo e a composição dos ácidos gordos totais presentes em microalgas é descrito. Os ácidos gordos são um dos principais constituintes de biomassa de microalgas. Estes ácidos gordos podem estar presentes em diferentes classes de acil-lípido. Especialmente os ácidos gordos presentes nos triacilgliceróis (TAG) são de interesse comercial, porque eles podem ser utilizados para a produção de combustíveis de transporte, os produtos químicos a granel, nutracêuticos (ω-3 ácidos gordos), e produtos alimentares. Para desenvolver aplicações comerciais, são necessários métodos analíticos confiáveis ​​para quantificação do teor de ácidos graxos e composição. Microalgas são células isoladas cercadas por uma parede celular rígida. Um método de análise de ácido gordo deve proporcionar ruptura suficiente de células para libertar todos os lípidos de acilo e o procedimento de extracção utilizado deve ser capaz de extrair todas as classes de lípidos de acilo.

Com o método aqui apresentado todos os ácidos gordos presentes no microalgas podem ser exacta e reprodutível idendos e quantificados utilizando pequenas quantidades de amostra (5 mg), independentemente da sua cadeia de comprimento, grau de insaturação, ou a classe de lipídios que fazem parte.

Este método não fornece informação sobre a abundância relativa de diferentes classes de lípidos, mas pode ser estendida para separar classes de lípidos de cada outro.

O método baseia-se numa sequência de ruptura mecânica da célula, a extracção de lípidos à base de solvente, a transesterificação dos ésteres de ácidos gordos a metílicos dos ácidos gordos (FAMEs), e quantificação e identificação dos EMAG utilizando cromatografia em fase gasosa (GC-FID). Uma norma interna TAG (tripentadecanoin) é adicionado antes do procedimento analítico para corrigir as perdas durante a extração e transesterificação incompleta.

Introdução

Os ácidos gordos são um dos principais constituintes de biomassa de microalgas e normalmente fazem-se entre 5-50% do peso seco da célula ^1-3. Eles estão presentes principalmente na forma de glycerolipids. Estes, por sua vez glycerolipids consistem principalmente de fosfolipídios, glicolipídios e triacilglicerol (TAG). Especialmente os ácidos graxos presentes no TAG são de interesse comercial, porque eles podem ser usados ​​como um recurso para a produção de combustíveis de transporte, produtos químicos a granel, nutracêuticos (ω-3 ácidos graxos) e produtos alimentares ^3-6. Microalgas podem crescer em meios de cultura à base de água do mar, pode ter uma produtividade de área muito maior do que as plantas terrestres, e podem ser cultivadas em fotobiorreatores em locais que não são adequados para a agricultura, possivelmente, até mesmo no mar. Por estas razões, as microalgas são muitas vezes considerados uma alternativa promissora para as plantas terrestres para a produção de biodiesel e outros produtos a granel ^3-6. Potencialmente nenhum l agrícolae ou de água doce (quando cultivadas em fotobiorreatores fechados ou quando microalgas marinhas são utilizadas) é necessário para a sua produção. Portanto, os biocombustíveis derivados de microalgas são consideradas 3 ^ª geração de biocombustíveis.

O conteúdo celular total de ácidos gordos (% de peso seco), a composição de classe de lípidos, bem como o ácido gordo de comprimento e grau de saturação é altamente variável entre espécies de microalgas. Além disso, estas propriedades variam com as condições de cultura, tais como a disponibilidade de nutrientes, temperatura, pH, e a intensidade da luz ^{de 1,2.} Por exemplo, quando expostos à privação de nitrogênio, as microalgas podem acumular grandes quantidades de TAG. Sob condições óptimas de crescimento TAG constitui tipicamente menos de 2% de peso seco, mas quando expostos a azoto inanição conteúdo de TAG pode aumentar até 40% do peso seco das microalgas ^1.

Microalgas principalmente produzir ácidos graxos com comprimentos de cadeia de 16 e 18átomos de carbono, mas algumas espécies podem produzir ácidos gordos de até 24 átomos de carbono de comprimento. Ambos saturado, bem como os ácidos gordos altamente insaturados são produzidos por microalgas. Estes últimos incluem ácidos graxos com benefícios nutricionais (ω-3 os ácidos gordos) como C20: 5 (ácido eicosapentaenóico, EPA) e C22: 6 (ácido docosahexaenóico, DHA) para os quais não existam alternativas vegetais ^1,2,4,7. O (distribuição de) ácidos graxos de comprimento de cadeia e grau de saturação também determina as propriedades e qualidade dos biocombustíveis derivados de algas e óleos comestíveis ^4,8.

Para desenvolver aplicativos comerciais de ácidos graxos de microalgas derivada, são necessários métodos analíticos confiáveis ​​para quantificação do teor de ácidos graxos e composição.

Como também apontado por Ryckebosch et al. ^9, a análise de ácidos graxos em microalgas se distingue de outros substratos (por exemplo, óleo vegetal, produtos alimentícios, tecidos animais, etc) sercausar 1) microalgas são células isoladas rodeadas por paredes celulares rígidas, o que complica a extracção de lípidos, 2) microalgas conter uma grande variedade de classes de lípidos e a distribuição de classe de lípidos é altamente variável ^7. Estas classes de lípidos diferentes têm uma grande variedade em termos de estrutura química e propriedades, tais como a polaridade. Além disso, outros lípidos de acilo classes de lípidos são produzidos, 3) microalgas conter uma grande variedade de ácidos gordos, desde 12-24 átomos de carbono de comprimento e contendo tanto saturado, bem como os ácidos gordos altamente insaturados. Assim, os métodos desenvolvidos para analisar os ácidos gordos em outros substratos de microalgas, pode não ser adequada para a análise de ácidos gordos em microalgas.

Como revisto por Ryckebosch et al. ^9, a diferença principal entre os procedimentos de extracção de lípidos vulgarmente usados ​​é nos sistemas de solventes que são usados. Por causa da grande variedade de classes de lípidos presentes no microalgas, cada um variando de polaridade, a extraídaquantidade de lípido irá variar de acordo com os solventes utilizados ^10-12. Isto leva a inconsistências no conteúdo e composição apresentada na literatura ^9,10 lipídico. Dependendo do sistema de solvente utilizado, os métodos baseados na extracção de solvente, sem ruptura da célula por meio de, por exemplo, batimento do grânulo ou de ultra-sons, pode não extrair todos os lípidos, devido à estrutura rígida de algumas espécies de microalgas ^9,13. No caso de extracção de lípidos incompleta, a eficiência da extracção de diferentes classes de lípidos pode variar ^14. Este pode também ter um efeito na composição de ácidos gordos medidos, porque a composição do ácido gordo é variável entre as classes de lípidos ^7.

O nosso método baseia-se numa sequência de ruptura mecânica da célula, a extracção de lípidos à base de solvente, a transesterificação dos ésteres de ácidos gordos a metílicos dos ácidos gordos (FAMEs), e quantificação e identificação dos EMAG utilizando cromatografia de gás, em combinação com uma ionização de chamadetector mento (GC-FID). Um padrão interno, na forma de um triacilglicerol (tripentadecanoin) é adicionado antes do procedimento analítico. Possíveis perdas durante a extração e transesterificação incompleta podem ser corrigidas. O método pode ser usado para determinar o conteúdo, bem como a composição dos ácidos gordos presentes na biomassa de microalgas. Todos os ácidos gordos presentes nas diferentes classes de acil-lípido, incluindo o armazenamento (TAG), bem como lípidos da membrana (glicolípidos, fosfolípidos), são detectados, identificados e quantificados com precisão e de forma reprodutível por este método usando apenas pequenas quantidades de amostra (5 mg) . Este método não fornece informações sobre a abundância relativa das diferentes classes de lipídios. No entanto, o método pode ser estendido para separar classes de lípidos do outro ^1. A composição de ácidos gordos e de concentração das diferentes classes de lípidos pode ser determinada individualmente.

Na literatura vários outros métodos sãodescrito para analisar os lipídios em microalgas. Alguns métodos de focar sobre o total de componentes lipofílicos ^15, enquanto que outros métodos de se concentrar em ácidos gordos totais ^9,16. Estas alternativas incluem determinação gravimétrica de lipídios totais extraídos, trans-esterificação direta de ácidos graxos combinados com quantificação utilizando cromatografia e coloração de células com corantes fluorescentes lipofílicos.

Uma das alternativas mais utilizada para a quantificação de ácidos gordos usando cromatografia é quantificação de lípidos utilizando uma determinação gravimétrica ^17,18. Vantagens de uma determinação gravimétrica são a falta de requisitos para equipamentos avançados e caros, como um cromatógrafo a gás, facilidade para definir o processo, por causa da disponibilidade de equipamento analítico padronizado (por exemplo Soxhlet), e uma determinação gravimétrica é menos demorado do que cromatografia de métodos baseados. A principal vantagem da utilização de métodos de cromatografia com base em other mão é que em tal método apenas os ácidos gordos são medidos. Numa determinação gravimétrica do ácido não gordo contendo lípidos, tais como pigmentos ou esteróides, são também incluídas na determinação. Estes lipídios ácido não gordo contendo pode fazer-se uma grande proporção (> 50%) do total de lipídios. Se alguém está interessado apenas no teor de ácidos gordos (por exemplo, para aplicações de biodiesel), ele vai ser superestimada quando uma determinação gravimétrica é usado. Além disso, na determinação gravimétrica a precisão da balança analítica utilizada para pesar os lípidos extraídos determina o tamanho da amostra que tem de ser usado. Esta quantidade é tipicamente muito mais do que a quantidade necessária quando é utilizada cromatografia. Finalmente, uma outra vantagem da utilização de cromatografia sobre determinação gravimétrica é que a cromatografia fornece informações sobre a composição de ácidos gordos.

Outra alternativa para o nosso método apresentado é ^16,19,20 transesterificação direta.Neste método de extracção de lípidos e de transesterificação de ácidos gordos para EMAGs são combinadas num único passo. Este método é mais rápido do que um passo de extracção e de transesterificação em separado, mas a combinação destes passos limita os solventes que podem ser utilizados para extracção. Isso pode influenciar negativamente a eficiência da extração. Outra vantagem de uma etapa de extracção de lípidos e de transesterificação é separada que permite uma separação adicional entre a classe de lípidos destes passos ^1. Isso não é possível quando transesterificação directa é utilizado.

Outros métodos comumente utilizados para determinar o teor de lipídios em microalgas incluem manchando a biomassa com manchas fluorescentes lipofílicos, como Nilo vermelho ou BODIPY e medir o sinal de fluorescência ^21,22. Uma vantagem destes métodos é que eles são menos trabalhoso que métodos alternativos. Uma desvantagem destes métodos é que a resposta fluorescente é, por várias razões, variável entre especies, as condições de cultivo, as classes de lipídios e procedimentos analíticos. Como exemplo, várias destas variações são causadas por diferenças na absorção do corante pelas microalgas. Portanto, é necessária calibração usando outro método quantitativo, de preferência realizada para todas as diferentes condições de cultivo e estágios de crescimento. Finalmente, este método não fornece informações sobre a composição de ácidos graxos e é menos preciso e reprodutível do que os métodos de cromatografia de base.

O método apresentado baseia-se no método descrito por Lamers et al. ²³ e ²⁴ Santos et al. E também foi aplicada por outros autores ^1,25-27. Também estão disponíveis outros métodos que são baseados nos mesmos princípios e pode fornecer resultados semelhantes ^9,28.

Protocolo

1. Preparação de Amostras

Existem dois protocolos alternativos para a preparação de amostras compreendidos como os passos 1.1 e 1.2. Ambos os métodos são igualmente adequados e dão resultados semelhantes, mas se uma quantidade limitada de volume da cultura de algas está disponível, o método 1,1 é recomendada.

NOTA: Para ambos os protocolos, preparar dois tubos talão batedor adicionais de acordo com o protocolo inteiro mas sem a adição de algas para que sejam usados ​​como um branco. Deste modo, os picos do cromatograma de GC resultante da extracção de componentes a partir de materiais usados ​​podem ser identificados e quantificados.

1.1. Preparação de amostras Protocolo Opção 1: recomendado quando uma quantidade limitada de Algas Cultura está disponível

1. Determinar a concentração de algas peso seco (g / L) no caldo de cultura, por exemplo, como descrito por Breuer et ai. ^1.
2. Transferir um volume de caldo de cultura que contém 5-10 mg de peso seco de algas paraum tubo de centrífuga de vidro. Calcule a quantidade exata de biomassa transferidos usando a concentração de biomassa determinada no passo 1.1.1.
3. Centrifugar 5 min a 1200 x g.
4. Descarte parte do sobrenadante, deixe cerca de 0,25 ml no tubo.
5. Re-suspender as algas no sobrenadante remanescente por pipetagem suave do sedimento cima e para baixo e transferir o sedimento de células completa para um tubo misturador de reforço usando uma pipeta de 200 uL.
6. Lavar o tubo de centrífuga de vidro e pipeta com ± 0,15 ml de água milliQ e transferir o líquido para o mesmo tubo de batedor de esferas.
7. Tubos de centrífuga de talão batedor durante um minuto a rotação máxima para garantir que não permanecem bolhas de ar na parte inferior dos tubos. É possível armazenar tubos talão batedor fechados à temperatura de -80 ° C.
8. Liofilização os tubos talão batedor contendo a amostra. É possível armazenar os tubos talão batedor fechados a -80 ° C.

1.2. Preparação de amostras Protocolo Opção 2

1. Centrifugar um volume indeterminado de caldo de cultura de algas e descartar o sobrenadante. Não é necessário para determinar a concentração de biomassa ou a medição do volume utilizado.
2. Medir ou calcular a osmolaridade do meio de cultura, utilizando a concentração dos sais principais presentes no meio de cultura.
3. Lava-se a pelete de células por ressuspensão do sedimento celular, no mesmo volume, tal como utilizado no passo 1.2.1, de uma solução de formato de amónio, o qual se aproxima a osmolaridade do meio de cultura. Uma solução de formato de amónio equiosmolar impede lise das células durante a lavagem das células.

NOTA: A lavagem de células é necessário para remover os sais presentes no meio de cultura. Isto é especialmente importante para a análise de ácidos gordos em microalgas marinhas porque as concentrações elevadas de sal no seu meio de cultura. Se os sais ainda estaria presente, isso iria causar superestimação da quantidade de peso seco de células que será determinado mais tarde, em tseu protocolo. Formato de amónio é usado para lavar as células porque esta solução irá evaporar-se durante a liofilização e não deixa qualquer resíduo.

4. Suspensão Centrífuga algas e elimine o sobrenadante.
5. Liofiliza-se o sedimento de células.
6. Pesar 5-10 mg de pó liofilizado de microalgas para um tubo de batedor de esferas. Registre o peso exato.

2. O rompimento celular e extração de lipídios

NOTA: Esta seção descreve um procedimento de rompimento celular extensa. Possivelmente, alguns dos passos rompimento celular são redundantes e menos extensa rompimento celular pode produzir os mesmos resultados para algumas espécies de microalgas ou para a biomassa derivada de certas condições de cultivo. Isto precisa de validação para cada situação específica no entanto. Portanto, o extenso protocolo rompimento proposto é recomendada como um método universal adequado para todos os materiais de microalgas.

1. Pesar uma quantidade exata de tripentadecanoin (triacylglycerol contendo três C15: 0 Ácidos gordos) e adiciona-se a uma quantidade conhecida com exactidão de 04:05 (v / v) de clorofórmio: metanol. Desta forma, a concentração de tripentadecanoin é exactamente conhecida. Apontar para uma concentração de 50 mg / L. Tripentadecanoin serve como padrão interno para quantificação de ácidos graxos.
2. Adicionar 1 ml de clorofórmio: metanol 04:05 (v / v) contendo tripentadecanoin a cada tubo de batimento (especificado nos reagentes e equipamento de mesa). Verificar que não existem pérolas que ficaram no interior da tampa do tubo de beadbeater, isto irá resultar em fugas dos tubos. Usar uma pipeta de deslocamento positivo para a adição exacta de solventes.
3. Bead bater os tubos talão batedor 8x a 2.500 rpm por 60 segundos, cada vez com um segundo 120 interna entre cada batimento.
4. Transferir a solução dos tubos talão batedor para a 15 ml tubo de centrífuga de vidro limpo, resistente ao calor com inserção Teflon screw-caps. Certifique-se de transferir todas as contas do tubo batedor talão também.
5. Para erah tubo batedor grânulo, adicionar 1 ml de clorofórmio: metanol 04:05 (v / v) contendo tripentadecanoin no tubo batedor talão, perto da tampa, misture e transfira esta solução para o mesmo tubo de vidro a partir do passo 2.4. Lavar o tubo três vezes (um total de 4 ml de clorofórmio: metanol 04:05 (v / v) contendo tripentadecanoin é utilizado por exemplo - 1 ml adicionados na etapa 2,2 e 3 ml de 3 passos de lavagem).
6. Vortex os tubos de vidro de 5 seg e sonicado num banho de ultra-sons durante 10 min.
7. Adicionar 2,5 ml de água MilliQ, contendo 50 mM de 2-amino-2-hidroximetil-propano-1 ,3-diol (tris) e 1 M de NaCl, a qual é definida como a pH 7 usando uma solução de HCl. Isto irá causar uma separação de fases entre clorofórmio e metanol: água. NaCl 1 M é usado para melhorar o equilíbrio de lípidos para a fase de clorofórmio.
8. Vortex durante 5 segundos e, em seguida, sonicar durante 10 min.
9. Centrifugar durante 5 minutos a 1200 x g.
10. Transferir toda a fase de clorofórmio (fase inferior) para um tubo de vidro limpo usando uma pipeta Pasteur de vidroe. Certifique-se a não transferir qualquer interfase ou fase superior.
11. Re-extrair a amostra por adição de 1 ml de clorofórmio ao tubo velho (contendo a solução de metanol: água).
12. Vortex durante 5 segundos e, em seguida, sonicar durante 10 min.
13. Centrifugar durante 5 minutos a 1200 x g.
14. Recolher a fase clorofórmio (fase inferior) com uma pipeta de Pasteur de vidro e piscina com a primeira fração clorofórmio do passo 2.10.
15. Se as dificuldades são vivenciadas na coleta da fração clorofórmio inteiro na etapa anterior, repita os passos de 2,11-2,14. Caso contrário, continue com a etapa 2.16.
16. Evapora-se o clorofórmio a partir do tubo num fluxo de azoto gasoso. Após este passo as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C sob uma atmosfera de azoto gasoso.

3. Transesterificação de ésteres metílicos de ácidos graxos

1. Adicionar 3 ml de metanol contendo 5% (v / v) de ácido sulfúrico para o tubo contendo os lípidos extraídos foram secos (tubo originalmente contêm a fracção de clorofórmio) efechar o tubo bem.
2. Vortex por 5 seg.
3. Incubar as amostras durante 3 horas a 70 ° C num bloco de aquecimento ou banho-maria. Periodicamente (a cada 30 min ±) garantir que as amostras não são fervente (causada por uma tampa de forma inadequada fechado) e tubos de vórtice. Durante esta reacção de ácidos gordos são metilados para os seus ésteres metílicos dos ácidos gordos (FAMEs).
4. Amostras de arrefecer à temperatura ambiente e adicionar 3 ml de água MilliQ e 3 ml de n-hexano.
5. Vortex durante 5 seg e misturar durante 15 minutos com um rotor tubo de ensaio.
6. Centrifugar durante 5 minutos a 1200 x g.
7. Recolher 2 ml da fase de hexano (em cima) e colocar no tubo de vidro fresco utilizando uma pipeta Pasteur de vidro.
8. Adicionar 2 ml de água MilliQ para a fase de hexano recolhido para lavá-la.
9. Vortex durante 5 seg e centrifuga-se durante 5 min a 1200 x g. Após este passo, é possível guardar as amostras a -20 ° C sob atmosfera de azoto gasoso (não necessária separação de fase).

4. Quantificação de L EMAGsCromatografia Gasosa cantar

1. Encher frascos de GC com a fase de hexano (fase superior) usando uma pipeta de Pasteur de vidro.
2. Coloque as tampas nos frascos de GC. Certifique-se as tampas são completamente selado, e não pode ser ligado, para evitar a evaporação a partir do frasco.
3. Encher os solventes de lavagem GC (hexano), esvazie os frascos de resíduos, e colocar em frascos de amostra auto-amostrador. Antes de executar as amostras reais no GC, executado pela primeira vez dois espaços em branco contendo apenas hexano no GC.
4. Executar as amostras sobre um GC-FID com uma coluna Nukol (30 mx 0,53 milímetros x 1,0 mm). Use uma temperatura de admissão de 250 ° C e utilizar hélio como gás transportador, a pressão de 81,7 kPa e taxa de divisão de 0,1:1, a taxa de fluxo total: 20 ml / min. FID temperatura do detector de 270 ° C com H ₂ taxa de fluxo de 40 ml / min, taxa de fluxo de ar de 400 ml / min e Ele taxa de 9,3 ml / min de fluxo. Definir o volume de injeção de 1 ml / amostra. Injetor de pré e pós-lavagem com n-hexano. Temperatura do forno inicial é definido como 90 ° C durante 0,5 min e, em seguida, levantadas with 20 ° C / min até uma temperatura do forno de 200 ° C, é alcançado. A temperatura do forno é depois mantida a 200 ° C durante 39 min. O tempo total de execução é de 45 min.

Resultados

Um cromatograma típico que é obtido através deste processo é mostrado na Figura 1. FAMEs são separados por tamanho e grau de saturação pela coluna GC e protocolo utilizado. Ácidos graxos de cadeia de comprimento mais curto e mais ácidos graxos saturados (menos ligações duplas) têm tempos de retenção mais curtos. A coluna GC usado eo protocolo não pretende separar isômeros de ácidos graxos (o mesmo comprimento da cadeia e grau de saturação, mas diferentes posições de ligações dupla...

Discussão

O método descrito pode ser usado para determinar o conteúdo, bem como a composição dos ácidos gordos totais presentes na biomassa de microalgas. Ácidos gordos derivados a partir de todas as classes de lípidos, incluindo o armazenamento (TAG), bem como lípidos da membrana (fosfolípidos e glicolípidos), são detectados. Todos os comprimentos de cadeias de ácidos gordos e de graus de saturação, que estão presentes no microalgas podem ser detectados e distinguidos. O método baseia-se na ruptura mecânica da c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent and equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
tripentadecanoin (C15:0 TAG)	Sigma Aldrich	T4257	CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Larodan
Beadbeater	Bertin Technologies	Precellys 24
beadbeater tubes	MP Biomedicals	Lysing matrix E 116914500
GC-FID	Hewlett-Packer	HP6871
GC column	Supelco	Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl	Mettler Toledo	MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000	Mettler Toledo	C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml	VWR	612-1925
glass tubes	VWR	SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000	VWR	SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps	VWR	SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator	VWR	445-2101
Heated Evaporator/Concentrator	Cole-Parmer	YO-28690-25