Analisi di acido grasso contenuto e la composizione in microalghe

Riepilogo

Procedimento per la determinazione del contenuto di acidi grassi e la composizione in microalghe basato su rottura meccanica delle cellule, estrazione dei lipidi solvente, transesterificazione, e quantificazione e identificazione di acidi grassi mediante gascromatografia è descritto. Uno standard interno tripentadecanoin viene utilizzato per compensare le eventuali perdite durante l'estrazione e transesterificazione incompleta.

Abstract

Un metodo per determinare il contenuto e la composizione degli acidi grassi totali presenti in microalghe è descritto. Gli acidi grassi sono un costituente importante della biomassa microalgale. Questi acidi grassi possono essere presenti in diverse classi acil-lipidico. Soprattutto acidi grassi presenti nel trigliceridi (TAG) grassi sono di interesse commerciale, perché possono essere utilizzate per la produzione di carburanti per il trasporto, prodotti chimici di base, nutraceutici (acidi grassi ω-3), e materie prime alimentari. Per sviluppare applicazioni commerciali, sono necessari metodi analitici affidabili per la quantificazione del contenuto di acidi grassi e composizione. Le microalghe sono singole cellule circondate da una parete cellulare rigida. Un metodo di analisi degli acidi grassi dovrebbe fornire rottura delle cellule sufficiente per togliere tutti i lipidi acilici e il procedimento di estrazione utilizzato deve essere in grado di estrarre tutte le classi acil lipidi.

Con il metodo qui presentato tutti gli acidi grassi presenti in microalghe possono essere accurato e riproducibile indivitificata e quantificato utilizzando piccole quantità di campione (5 mg) indipendentemente dalla loro lunghezza di catena, grado di insaturazione, o la classe di lipidi fanno parte.

Questo metodo non fornisce informazioni sulla relativa abbondanza di differenti classi di lipidi, ma può essere estesa per separare classi di lipidi tra loro.

Il metodo si basa su una sequenza di rottura meccanica delle cellule, estrazione dei lipidi solvente, transesterificazione di acidi grassi ad esteri metilici di acidi grassi (FAME), e quantificare e identificare FAMEs mediante gascromatografia (GC-FID). Uno standard interno TAG (tripentadecanoin) è aggiunto prima della procedura analitica per correggere le perdite durante l'estrazione e la transesterificazione incomplete.

Introduzione

Gli acidi grassi sono uno dei maggiori costituenti della biomassa microalgali e tipicamente costituiscono tra 5-50% del peso secco cellulare ^1-3. Essi sono principalmente presenti nella forma di glycerolipids. Questi glycerolipids a loro volta costituiti principalmente da fosfolipidi, glicolipidi e trigliceridi (TAG). In particolare gli acidi grassi presenti nel TAG sono di interesse commerciale, in quanto possono essere utilizzati come una risorsa per la produzione di carburanti per il trasporto, prodotti chimici di base, nutraceutici (acidi grassi ω-3), e prodotti alimentari ^3-6. Le microalghe possono crescere in mezzi di coltura di mare a base di acqua, può avere una produttività areale molto più alta rispetto alle piante terrestri, e può essere coltivata in fotobioreattori in luoghi che non sono adatti per l'agricoltura, forse anche in mare aperto. Per queste ragioni, microalghe sono spesso considerati una promettente alternativa alle piante terrestri per la produzione di biodiesel e altri prodotti sfusi ^3-6. Potenzialmente non l agricolae o acqua fresca (quando coltivati ​​in fotobioreattori chiusi o quando si utilizzano microalghe marine) è necessario per la loro produzione. Pertanto, i biocarburanti derivati ​​da microalghe sono considerati biocarburanti di 3 ^° generazione.

Il contenuto cellulare totale di acidi grassi (% del peso secco), la composizione di classe dei lipidi, come pure la lunghezza degli acidi grassi e grado di saturazione sono altamente variabile tra le specie di microalghe. Inoltre, queste proprietà variano a seconda delle condizioni di coltura, quali la disponibilità di nutrienti, temperatura, pH, e l'intensità della luce ^1,2. Ad esempio, se esposti a fame di azoto, le microalghe possono accumulare grandi quantità di TAG. In condizioni di crescita ottimali TAG costituisce tipicamente meno del 2% del peso secco, ma quando esposti ad azoto fame contenuto TAG può aumentare fino al 40% del peso secco microalghe ^1.

Le microalghe producono principalmente acidi grassi con lunghezze di catena di 16 e 18atomi di carbonio, ma alcune specie possono rendere acidi grassi fino a 24 atomi di carbonio di lunghezza. Sia saturo sia di acidi grassi altamente insaturi sono prodotte da microalghe. Questi ultimi comprendono acidi grassi con benefici nutrizionali (acidi grassi ω-3) come C20: 5 (acido eicosapentaenoico, EPA) e C22: 6 (acido docosaesaenoico, DHA), per cui non esistono alternative vegetali ^1,2,4,7. L'(distribuzione di) acidi grassi lunghezza della catena e grado di saturazione determina anche le caratteristiche e la qualità dei biocarburanti derivanti dalle alghe e oli commestibili ^4,8.

Per sviluppare applicazioni commerciali di acidi grassi microalghe derivato, sono necessari metodi analitici affidabili per la quantificazione del contenuto di acidi grassi e composizione.

Come anche sottolineato da Ryckebosch et al. ^9, l'analisi degli acidi grassi a microalghe si distingue da altri substrati (ad esempio olio vegetale, prodotti alimentari, tessuti animali, ecc) BEcausare 1) microalghe unicellulari sono circondate da pareti cellulari rigide, complicando estrazione dei lipidi; 2) microalghe contengono un'ampia varietà di classi di lipidi e la distribuzione classe di lipidi è altamente variabile ^7. Queste diverse classi di lipidi hanno una grande varietà nella struttura e proprietà come polarità chimica. Inoltre, classi di lipidi diversi dai lipidi acilici sono prodotte; 3) microalghe contengono un'ampia varietà di acidi grassi, che vanno 12-24 atomi di carbonio di lunghezza e contenente sia saturo sia di acidi grassi altamente insaturi. Pertanto, i metodi sviluppati per analizzare acidi grassi in substrati diversi microalghe, potrebbero non essere adatto per analizzare acidi grassi in microalghe.

Come recensito da Ryckebosch et al. ^9, la differenza principale tra procedure di estrazione dei lipidi comunemente utilizzati sia nel solvente sistemi che vengono utilizzati. A causa della grande varietà di classi di lipidi presenti in microalghe, ognuna diversa polarità, l'estrattoquantità di lipidi varia con solventi utilizzati ^10-12. Questo porta a incongruenze nel contenuto lipidico e gli allestimenti presentati in letteratura ^9,10. A seconda del sistema solvente usato, metodi basati sulla estrazione con solvente senza distruzione cellulare attraverso, per esempio, branello battitura o sonicazione, potrebbero non estrarre tutti i lipidi a causa della struttura rigida di alcune specie di microalghe ^9,13. Nel caso di estrazione dei lipidi incompleta, l'efficienza di estrazione delle varie classi di lipidi può variare ^14. Questo può anche avere un effetto sulla composizione in acidi grassi misurato, perché la composizione in acidi grassi è variabile tra classi di lipidi ^7.

Il nostro metodo si basa su una sequenza di rottura meccanica delle cellule, estrazione dei lipidi solvente, transesterificazione di acidi grassi ad esteri metilici di acidi grassi (FAME), e quantificare e identificare FAMEs mediante gascromatografia in combinazione con una ionizzazione di fiammaRivelatore zione (GC-FID). Uno standard interno nella forma di un triacilglicerolo (tripentadecanoin) è aggiunto prima della procedura analitica. Possibili perdite durante l'estrazione e la transesterificazione incomplete possono essere corretti per. Il metodo può essere utilizzato per determinare il contenuto e la composizione degli acidi grassi presenti nelle biomasse microalgali grassi. Tutti gli acidi presenti nelle diverse classi acil-lipidico e stoccaggio (TAG) e lipidi di membrana (glicolipidi, fosfolipidi), vengono rilevati, identificati e quantificati accurato e riproducibile con questo metodo utilizzando solo piccole quantità di campione (5 mg) di grassi . Questo metodo non fornisce informazioni sulla abbondanza relativa delle diverse classi di lipidi. Tuttavia, il metodo può essere esteso per separare classi di lipidi tra loro ^1. La composizione in acidi grassi e la concentrazione delle varie classi di lipidi può essere determinata individualmente.

In letteratura molti altri metodi sonodescritto analizzare lipidi in microalghe. Alcuni metodi si concentrano su un totale di componenti lipofile ^15, mentre gli altri metodi si concentrano sugli acidi grassi totali ^9,16. Tali alternative includono la determinazione gravimetrica del totale dei lipidi estratti, trans-esterificazione diretta di acidi grassi combinati con quantificazione mediante cromatografia, e le cellule colorazione con coloranti fluorescenti lipofile.

Un'alternativa comunemente usato per la quantificazione di acidi grassi mediante cromatografia è quantificazione dei lipidi utilizzando una determinazione gravimetrica ^17,18. I vantaggi di una determinazione gravimetrica sono la mancanza di requisiti di avanzate e costose apparecchiature come un gascromatografo, facilità di impostare la procedura, a causa della disponibilità di attrezzature analitiche standardizzate (ad es Soxhlet), ed una determinazione gravimetrica è meno dispendio di tempo rispetto cromatografia metodi basati. Il principale vantaggio di utilizzare metodi di cromatografia basata sulla OTHer mano è che in un tale metodo solo gli acidi grassi vengono misurate. In una determinazione gravimetrica l'acido non grasso contenenti lipidi, come i pigmenti o steroidi, sono inclusi anche nella determinazione. Questi lipidi acidi non grassi contenenti può fare una grande percentuale (> 50%) dei lipidi totali. Se si è interessati solo al contenuto di acidi grassi (ad esempio per applicazioni biodiesel), sarà sovrastimato quando si utilizza una determinazione gravimetrica. Inoltre, in una determinazione gravimetrica la precisione della bilancia analitica utilizzata per pesare i lipidi estratti determina la dimensione del campione che deve essere utilizzato. Questa quantità è in genere molto più che la quantità necessaria quando si utilizza la cromatografia. Infine, un altro vantaggio di usare cromatografia su determinazione gravimetrica è che cromatografia fornisce informazioni sulla composizione in acidi grassi.

Un'altra alternativa per il nostro metodo presentato è ^16,19,20 transesterificazione diretta.In questo metodo di estrazione dei lipidi e transesterificazione di acidi grassi a FAMEs sono combinati in un unico passaggio. Questo metodo è più veloce di una fase di estrazione e transesterificazione separato, ma combinando seguente procedura limita i solventi che possono essere utilizzati per l'estrazione. Ciò potrebbe influenzare negativamente l'efficienza di estrazione. Un altro vantaggio di una fase di estrazione dei lipidi e transesterificazione separata è che permette una separazione classe di lipidi aggiuntivo tra questi passaggi ^1. Questo non è possibile se si utilizza transesterificazione diretta.

Altri metodi comunemente usati per determinare il contenuto di lipidi microalghe includono la colorazione della biomassa con macchie fluorescenti lipofile come il Nilo rosso o BODIPY e misurando il segnale di fluorescenza ^21,22. Un vantaggio di questi metodi è che sono meno laborioso rispetto ai metodi alternativi. Uno svantaggio di questi metodi è che la risposta fluorescente è, per vari motivi, variabile tra species, condizioni di coltivazione, classi di lipidi, e le procedure analitiche. Come esempio, molti di queste variazioni sono causate da differenze nella diffusione del colorante dal microalghe. È quindi necessaria la calibrazione utilizzando un altro metodo quantitativo, preferibilmente eseguita per tutte le diverse condizioni di coltivazione e le fasi di crescita. Infine, questo metodo non fornisce informazioni sulla composizione in acidi grassi ed è meno preciso e riproducibile di metodi di cromatografia base.

Il metodo proposto si basa sul metodo descritto da Lamers et al. ²³ e Santos et al. ²⁴ ed è stata applicata anche da vari altri autori ^1,25-27. Anche altri metodi sono disponibili che si basano sugli stessi principi e potrebbe fornire risultati simili ^9,28.

Protocollo

1. Preparazione del campione

Ci sono due protocolli alternativi per il campione preparato incluso come passi 1.1 e 1.2. Entrambi i metodi sono ugualmente adatti e danno risultati simili, ma se una quantità limitata di alghe volume di cultura è disponibile, si consiglia il metodo 1.1.

NOTA: Per entrambi i protocolli, preparare due tubi branello dosatori supplementari secondo l'intero protocollo ma senza aggiungere alghe per poter essere utilizzate come bianco. In questo modo, i picchi del cromatogramma GC risultante dall'estrazione delle componenti di materiali utilizzati possono essere identificati e quantificati.

1.1. Preparazione del campione protocollo Opzione 1: Consigliato Quando una quantità limitata di alghe cultura è disponibile

1. Determinare la concentrazione alghe peso secco (g / L) in brodo di coltura, ad esempio come descritto da Breuer et al. ^1.
2. Trasferire un volume di brodo di coltura che contiene 5-10 mg alghe peso secco diuna provetta da centrifuga vetro. Calcolare l'importo esatto della biomassa trasferiti utilizzando la concentrazione della biomassa determinata nella fase 1.1.1.
3. Centrifugare 5 min a 1.200 x g.
4. Scartare parte del surnatante, lasciare circa 0,25 ml nel tubo.
5. Risospendere le alghe nel supernatante residuo delicatamente pipettando pellet su e giù e trasferire il pellet cellulare completa ad un tubo battitore tallone con una pipetta 200 microlitri.
6. Risciacquare la pipetta provetta da centrifuga e bicchiere con acqua ± 0,15 ml MilliQ e trasferire il liquido allo stesso tubo battitore tallone.
7. Provette da centrifuga branello dosatori per un minuto alla massima rpm per assicurarsi che non rimangano bolle d'aria nella parte inferiore dei tubi. E 'possibile memorizzare i tubi tallone battitore chiuso a -80 ° C.
8. Liofilizzare i tubi tallone dosatori contenenti il ​​campione. È possibile memorizzare i tubi branello dosatori chiusi a -80 ° C.

1.2. Esempio di Opzione Preparazione protocollo 2

1. Centrifugare un volume non di cultura alghe brodo e scartare il surnatante. Non è necessario per determinare la concentrazione della biomassa o per misurare il volume utilizzato.
2. Misurare o calcolare l'osmolarità del mezzo di coltura utilizzando la concentrazione dei principali sali presenti nel terreno di coltura.
3. Lavare il pellet cellulare da risospendere il pellet cellulare nello stesso volume, come usato nella fase 1.2.1, di una soluzione di formiato di ammonio, che approssima l'osmolarità del mezzo di coltura. Una soluzione di formiato di ammonio equiosmolar impedisce lisi delle cellule durante il lavaggio delle cellule.

NOTA: Lavare le cellule è necessario rimuovere i sali presenti nel terreno di coltura. Questo è particolarmente importante per l'analisi degli acidi grassi in microalghe marine causa delle alte concentrazioni di sale nel loro terreno di coltura. Se sali sarebbero ancora presenti, ciò causerebbe sovrastima della quantità di peso secco cellulare, che verrà determinato successivamente in til suo protocollo. Ammonio formiato è usato per lavare le cellule, perché questa soluzione sarà completamente evaporare durante la liofilizzazione e non lascia residui.

4. Sospensione Centrifuga alghe e scarti surnatante.
5. Liofilizzare il pellet di cellule.
6. Pesare 5-10 mg di polvere liofilizzata di microalghe in un tubo battitore tallone. Registrare il peso esatto.

2. Turbativa delle cellule e dei lipidi estrazione

NOTA: Questa sezione descrive una vasta procedura di distruzione cellulare. Forse, alcuni dei passaggi rottura delle cellule sono ridondanti e meno estesa distruzione cellulare potrebbe produrre gli stessi risultati di alcune specie di microalghe o per la biomassa derivata da alcune condizioni di coltivazione. Ciò avrebbe bisogno di convalida per ogni situazione specifica però. Pertanto, l'ampio protocollo perturbazione proposto è raccomandato come un metodo universale adatto per tutti i materiali microalghe.

1. Pesare una quantità esatta di tripentadecanoin (TRiacylglycerol contenente tre C15: 0 acidi grassi) e inserirlo di una quantità esattamente noto 4:5 (v / v) cloroformio: metanolo. In questo modo la concentrazione di tripentadecanoin è esattamente conosciuta. Puntare ad una concentrazione di 50 mg / L. Tripentadecanoin serve come standard interno per la quantificazione di acidi grassi.
2. Aggiungere 1 ml di cloroformio: metanolo 04:05 (v / v) contenente tripentadecanoin a ciascun tubo di mantecazione (specificato nei reagenti e apparecchiature tabella). Verificare che non vi siano perline rimanenti all'interno della calotta del tubo beadbeater, questo si tradurrà in perdite dei tubi. Utilizzare una pipetta a spostamento positivo per un accurato aggiunta di solventi.
3. Bead battere i tubi tallone battitore 8x a 2.500 rpm per 60 secondi, ogni volta con un 120 sec interna tra ogni battito.
4. Trasferire la soluzione dai tubi tallone battitore per un ambiente pulito 15 ml provetta di vetro resistente al calore con inserti in teflon tappi a vite. Accertarsi di trasferire tutte le perline dal tubo battitore tallone pure.
5. Per statoh il tubo battitore tallone, aggiungere 1 ml di cloroformio: metanolo 04:05 (v / v) contenente tripentadecanoin nel tubo battitore tallone, vicino tappo e mescolare e trasferire questa soluzione per lo stesso tubo di vetro dal punto 2.4. Lavare il tubo per tre volte (in totale 4 ml di cloroformio: metanolo 04:05 (v / v) contenente tripentadecanoin viene utilizzato per campione - 1 ml aggiunti nel passaggio 2.2 e 3 ml per 3 fasi di lavaggio).
6. Agitare vetro per 5 sec e ultrasuoni in un bagno di sonicazione per 10 min.
7. Aggiungere 2,5 ml di acqua MilliQ, contenente 50 mM 2-ammino-2-idrossimetil-propan-1 ,3-diolo (Tris) e 1 M NaCl, che è impostato a pH 7 con una soluzione di HCl. Questo provocherà una separazione di fase tra cloroformio e metanolo: acqua. 1 M NaCl è utilizzato per migliorare l'equilibrio dei lipidi verso la fase cloroformio.
8. Vortex per 5 secondi e poi con ultrasuoni per 10 min.
9. Centrifugare per 5 minuti a 1200 x g.
10. Trasferire l'intera fase di cloroformio (fase inferiore) in una provetta di vetro pulita tramite pipett Pasteur di vetroe. Assicurarsi di non trasferire qualsiasi interfase o fase superiore.
11. Estrarre nuovamente il campione aggiungendo 1 ml di cloroformio al vecchio tubo (contenente il metanolo: soluzione acquosa).
12. Vortex per 5 secondi e poi con ultrasuoni per 10 min.
13. Centrifugare per 5 minuti a 1200 x g.
14. Raccogliere la fase cloroformio (fase inferiore) con una pipetta Pasteur di vetro e la piscina con la prima frazione di cloroformio dal punto 2.10.
15. In caso di difficoltà sono esperti nel raccogliere tutta la frazione di cloroformio nel passaggio precedente, ripetere i passaggi 2,11-2,14. Altrimenti procedere con il passo 2.16.
16. Si evapora il cloroformio dal tubo in una corrente di gas azoto. Dopo questo passo campioni possono essere conservati a -20 ° C sotto atmosfera di azoto gassoso.

3. Transesterificazione di esteri metilici degli acidi grassi

1. Aggiungere 3 ml di metanolo contenente 5% (v / v) di acido solforico al tubo contenente i lipidi estratti secchi (tubo originariamente contenenti la frazione cloroformio) echiudere ermeticamente la provetta.
2. Vortex per 5 sec.
3. Incubare campioni per 3 ore a 70 ° C in una stufa blocco o bagnomaria. Periodicamente (ogni ± 30 min) garantire che i campioni non sono bollente (causato da un coperchio in modo improprio chiuso) e tubi vortex. Durante questa reazione acidi grassi sono metilate a loro esteri metilici di acidi grassi (FAME).
4. Campioni raffreddare a temperatura ambiente e aggiungere 3 ml di acqua MilliQ e 3 ml di n-esano.
5. Vortex per 5 sec e miscelare per 15 minuti con un rotatore provetta.
6. Centrifugare per 5 minuti a 1200 x g.
7. Raccogliere 2 ml della fase di esano (in alto) e mettere in tubo di vetro fresco con una pipetta Pasteur di vetro.
8. Aggiungere 2 ml di acqua MilliQ alla fase esano raccolto per lavarlo.
9. Vortex per 5 secondi e centrifugare per 5 minuti a 1200 x g. Dopo questa fase è possibile conservare i campioni a -20 ° C sotto atmosfera di azoto gassoso (separazione di fase non necessario).

4. Quantificazione del FAMEs Ucantare gascromatografia

1. Riempire fiale GC con la fase di esano (fase superiore) con una pipetta Pasteur di vetro.
2. Posizionare i tappi sulle fiale GC. Assicurarsi che i tappi sono completamente sigillati, e non possono essere attivati, per evitare l'evaporazione dal flaconcino.
3. Riempire i solventi di lavaggio GC (esano), svuotare le fiale dei rifiuti, e mettere vial di campioni in auto-campionatore. Prima di eseguire i campioni reali sul GC, prima esecuzione 2 spazi vuoti che contengono solo esano sul GC.
4. Eseguire i campioni su un GC-FID con una colonna Nukol (30 mx 0,53 millimetri x 1,0 micron). Utilizzare temperatura di ingresso di 250 ° C e utilizzando elio come gas di trasporto, pressione di 81,7 kPa e rapporto di divisione di 0,1:1, portata totale: 20 ml / min. FID temperatura del rivelatore di 270 ° C con H ₂ velocità di flusso di 40 ml / min, portata d'aria di 400 ml / min ed Egli portata di 9,3 ml / min. Impostare volume di iniezione di 1 ml / campione. Iniettore pre e post lavaggio con n-esano. Temperatura iniziale del forno è impostato a 90 ° C per 0,5 minuti e poi sollevato spiritoh 20 ° C / min fino a una temperatura del forno di 200 ° C viene raggiunto. La temperatura del forno viene quindi mantenuta a 200 ° C per 39 min. Tempo di esecuzione totale è di 45 min.

Risultati

Un tipico cromatogramma che viene ottenuta tramite questo processo è mostrato nella Figura 1. FAMEs sono separati da dimensioni e grado di saturazione della colonna GC e protocollo utilizzato. Gli acidi grassi a catena più brevi di lunghezza e più acidi grassi saturi (meno legami matrimoniali) hanno tempi di ritenzione brevi. La colonna GC utilizzato e il protocollo non intendono separare isomeri degli acidi grassi (stessa catena di lunghezza e grado di saturazione, ma diverse posizioni di doppi lega...

Discussione

Il metodo descritto può essere utilizzato per determinare il contenuto e la composizione degli acidi grassi totali presenti nella biomassa microalgali. Acidi grassi ottenuti da tutte le classi di lipidi e stoccaggio (TAG) e lipidi di membrana (fosfolipidi e glicolipidi), vengono rilevati. Tutte le lunghezze di catene di acidi grassi e gradi di saturazione che sono presenti nel microalghe possono essere rilevati e distinti. Il metodo si basa sulla rottura meccanica delle cellule, estrazione dei lipidi solvente, transest...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent and equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
tripentadecanoin (C15:0 TAG)	Sigma Aldrich	T4257	CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Larodan
Beadbeater	Bertin Technologies	Precellys 24
beadbeater tubes	MP Biomedicals	Lysing matrix E 116914500
GC-FID	Hewlett-Packer	HP6871
GC column	Supelco	Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl	Mettler Toledo	MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000	Mettler Toledo	C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml	VWR	612-1925
glass tubes	VWR	SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000	VWR	SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps	VWR	SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator	VWR	445-2101
Heated Evaporator/Concentrator	Cole-Parmer	YO-28690-25