Mikroalglerden yağlı asit içeriği ve bileşimi analizi

Özet

Mekanik hücre bozulması, solvent esaslı lipid ekstraksiyonu, transesterifikasyon ve miktar tayini ve gaz kromatografisi kullanılarak yağ asitlerinin tanımlanması göre mikroalg yağlı asit içeriği ve bileşimin belirlenmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Bir tripentadecanoin iç standart ekstraksiyon ve eksik transesterifikasyon esnasında muhtemel kayıpları telafi etmek için kullanılır.

Özet

Mikroalg içinde mevcut toplam yağ asitlerinin içerik ve bileşimin belirlenmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Yağ asitleri mikroalg biyokütle önemli bir bileşeni vardır. Bu yağ asitleri, farklı lipid açil-sınıfları içinde mevcut olabilir. Bunlar taşıma yakıtlar, dökme kimyasallar, nutrasötikler (ω-3 yağ asitleri) ve gıda maddelerinin üretimi için kullanılabilir, çünkü özellikle triaçilgliserol (TAG) olarak mevcut olan yağ asitleri, ticari ilgi çekmektedir. Ticari uygulamaları geliştirmek için, yağlı asit içeriği ve bileşimin ölçülmesi için güvenilir analitik yöntemlere ihtiyaç vardır. Mikroalg katı bir hücre duvarı ile çevrelenmiş bir hücrelerdir. Bir yağ asidi analizi yöntemi tüm asil lipidler ve kullanılan ekstraksiyon prosedürü tüm asil lipit sınıfları ayıklamak gerekir kurtarmak yeterli hücre parçalanmasından sağlamalıdır.

Burada sunulan yöntem ile mikroalg içinde mevcut bütün yağ asitlerinin kimliklerini, doğru ve tekrarlanabilir bir olabilir,tified ve zincir uzunluğu, doymamışlık derecesi veya lipit sınıfının parçası oldukları bağımsız numunenin küçük miktarlarda (5 mg) kullanılarak değerlendirilmiştir.

Bu yöntem, farklı lipid sınıfların görece bolluğu hakkında bilgi sağlamaz, ancak birbirinden lipit sınıfları ayırmak için uzatılabilir.

Yöntem, mekanik hücre bozulması, solvent bazlı lipid ekstraksiyonu, yağlı asit metil esterleri (FAME) için yağlı asitlerin esterlenmesi ve miktar tayini ve gaz kromatografisi (GC-FID) kullanılarak FAME tanımlanması bir dizi dayanmaktadır. TAG bir iç standart (tripentadecanoin) çıkarma ve eksik transesterifikasyon esnasında zararları düzeltmek için önce analitik prosedüre eklenir.

Giriş

Yağ asitleri mikroalg biyokütlenin en önemli bileşenlerinden biri olan ve tipik olarak hücre kuru ağırlığına ^1-3 5-50% arasında oluşturan bulunmaktadır. Bunlar gliserolipidler şeklinde esas almaktadır. Bu da bu gliserolipidleri esas fosfolipidler, glikolipidler ve triaçilgliserol (TAG) oluşur. Bunlar taşıma yakıtlar, dökme kimyasallar, nutrasötikler (ω-3 yağ asitleri) ve gıda maddelerinin ^3-6 üretimi için bir kaynak olarak kullanılabilir, çünkü özellikle TAG içinde mevcut olan yağ asitleri, ticari ilgi çekmektedir. Mikroalg, deniz suyu bazlı ekimi medya büyüyebilir karasal bitkilerin çok daha yüksek bir alansal verimlilik olabilir, ve hatta deniz, tarım için uygun olmayan yerlerde fotobiyoreaktörler ekili olabilir. Bu nedenlerden dolayı, genellikle mikroalg biyodizel ve dökme ürünler ^3-6 üretimi için karasal bitkiler için umut verici bir alternatif olarak kabul edilir. Potansiyel hiçbir tarım lve veya tatlı su (kapalı fotobiyoreaktörler veya zaman içinde yetiştirilmiş deniz mikroalglanmn kullanılır) kendi üretimi için gereklidir. Bu nedenle, microalglerin türetilmiş biyoyakıt ^3. nesil biyoyakıt olarak kabul edilir.

Yağ asitleri (kuru ağırlık% 'si), lipid sınıf bileşimin, hem de yağ asidi uzunluk ve doyma derecesi toplam hücre içeriği mikroalg türler arasında oldukça değişkendir. Ayrıca, bu gibi besin özellikleri, sıcaklık, pH, ve ışık yoğunluğu gibi ^1,2 yetiştirme koşullarına göre değişir. Azot açlık maruz kaldığında, örneğin, mikroalg TAG büyük miktarlarda birikebilir. Optimal gelişim koşulları altında TAG genellikle kuru ağırlığının en az% 2'sini oluşturur, ancak azot açlık TAG içeriğine maruz mikroalg kuru ağırlığının ^{1 ile%} 40 kadar artırabilir.

Mikroalg esas olarak 16 ve 18 arasında zincir uzunlukları olan yağlı asitlerin üretilmesiC-atomlu sikloalkil, ancak bazı türler uzunluğunda en çok 24 karbon atomlu yağ asitleri yapabilir. Yüksek ölçüde doymamış yağ asitleri mikroalg tarafından üretilen her iki yanı sıra, doymuş. 6 (dokosaheksaenoik asit, DHA) hiç bitkisel alternatifler ^1,2,4,7 mevcut olduğu için: ve C22 5 (EPA eikosapentaenoik asit): Bu ikinci C20 gibi besin yararları (ω-3 yağ asitleri) olan yağ asitleri içerir. Yağ asidi zincir uzunluğu ve doygunluk derecesi (dağılımı) aynı zamanda yosun kaynaklı biyoyakıt ve yemeklik yağların ^4,8 özelliklerini ve kalitesini belirler.

Mikroalg türetilen yağlı asitlerin ticari uygulamaları geliştirmek için, yağlı asit içeriği ve bileşimin ölçülmesi için güvenilir analitik yöntemlere ihtiyaç vardır.

Olarak da Ryckebosch ark. Tarafından ⁹ işaret, microalglerin yağ asitlerinin analizi (örneğin bitkisel yağ, gıda ürünleri vb hayvansal dokular) olmak başka yüzeylerde ayrılıyorneden 1) mikroalgler lipid ekstraksiyon zorlaştıran, sert hücre duvarları ile çevrili tek hücrelerdir; 2) mikroalgler lipit sınıfları geniş bir yelpazede içerir ve lipit sınıf dağılımı ⁷ derece değişkendir. Bu farklı lipit sınıfları, kimyasal yapısı ve bu gibi polarite özellikleri geniş bir çeşitlilik vardır. Aynı zamanda, lipid asil başka lipit sınıfları üretilmektedir, 3) mikroalg uzunluğu 12-24 karbon atomu arasında değişen ve her iki doymuş hem de yüksek ölçüde doymamış yağ asitleri ihtiva eden, yağlı asitler geniş bir yelpazede içerir. Bu nedenle, başka alt-tabakalar mikroalg yağ asitleri analiz etmek için geliştirilen yöntemler, mikroalg yağ asitleri analiz etmek için uygun olmayabilir.

Ryckebosch et al. ⁹ tarafından gözden olarak, yaygın olarak kullanılan lipid ekstraksiyon işlemleri arasındaki temel fark, kullanılan çözücü sistemleri bulunmaktadır. Çünkü mikroalg mevcut lipid sınıfların geniş çeşitliliği, her bir kutup arasında değişen, ekstraktlipid miktarı ^10-12 kullanılan çözücülerin göre değişir. Bu durum, lipid içeriğine ve kompozisyon literatür ^9,10 sunulan tutarsızlık yol açar. Kullanılan çözücü sistemine bağlı olarak, üzerinden hücre bozulma olmadan solvent ekstraksiyon işlemlerinde kullanılan yöntemler, örneğin, boncuk dayak veya ultrasonik titreşim nedeniyle bir mikroalg türlerinin ^9,13 bükülmez yapının tüm lipidlerin çıkarılmasına olabilir. Eksik lipid ekstraksiyon yapılması halinde ise, farklı lipid sınıfların ekstraksiyon verimi ¹⁴ değişebilir. Yağ asidi bileşimi, lipit sınıfları ⁷ arasındaki değişken olduğu için bu, aynı zamanda, ölçülen yağlı asit bileşimi üzerinde bir etkisi olabilir.

Önerilen yöntem, mekanik hücre bozulması, lipid bazlı solvent ekstraksiyon, yağlı asit metil esterleri (FAME) için yağlı asitlerin esterlenmesi ve miktar ve bir alev ioniza ile bir arada gaz kromatografisini kullanarak FAME tanımlanması bir dizi dayanırtion dedektörü (GC-FID). Bir triaçilgliserol (tripentadecanoin) şeklinde bir iç standart önce analitik prosedüre eklenir. Ekstraksiyon ve eksik transesterifikasyon esnasında olası zararlar daha sonra düzeltilebilir. Bir yöntem olup, içeriğinin belirlenmesi hem de mikroalg biyokütle içinde mevcut olan yağlı asitlerin bileşim için kullanılabilir. Depolama (TAG) da dahil olmak üzere hem de membran lipitleri (glikolipitler, fosfolipitler) tespit edilir, örnek yalnızca küçük miktarda (5 mg) kullanılarak belirlendi ve bu yöntem ile, doğru ve tekrarlanabilir bir miktarı, farklı lipid açil-sınıfları içinde mevcut bütün yağ asitlerinin . Bu yöntem, farklı lipid sınıfların görece bolluğu hakkında bilgi sağlamaz. Bununla birlikte, bu yöntem birbirini ¹ lipit sınıfları ayırmak için uzatılabilir. Farklı sınıfların lipid konsantrasyonu ve yağlı asit bileşimi daha sonra ayrı ayrı tespit edilebilir.

Literatürde birçok yöntem vardırmikroalg lipitlerini analiz etmek için tarif edildiği. Diğer yöntemler, toplam yağ asitleri ^9,16 odaklanmak oysa Bazı yöntemler, toplam lipofilik bileşenlerin ^15. odaklanmak. Bu alternatifler çıkarılan toplam lipidlerin gravimetrik belirlenmesi, kromatografisi kullanılarak miktar ile birlikte yağ asitlerinin doğrudan trans-esterleştirme ve lipofilik florasan boyalarla boyanan hücreleri içerir.

Kromatografisi ile yağ asitlerinin miktarının için genel olarak kullanılan bir alternatif, bir gravimetrik belirlenmesi ^17,18 kullanılarak lipidlerin miktar olduğunu. Çünkü standart analitik donanımları (örn. Soklet) kullanılabilirliği, prosedürü kurmak kolay,, bir gravimetrik tayini Avantajları gazkromatograf'ın gibi gelişmiş ve pahalı ekipman için şartların eksikliği ve bir gravimetrik tayini daha az zaman harcayarak daha kromatografi yöntemleri göre. Oth üzerinde kromatografi dayalı yöntemler kullanmanın büyük avantajıer el Böyle bir yöntemde, sadece yağ asitleri ölçülür olmasıdır. Gravimetrik belirlenmesinde pigmentler veya steroidler gibi lipidler içeren non-yağlı asit, aynı zamanda belirlenmesi dahildir. Bu non-yağ asidi içeren lipidler toplam lipidlerin büyük bir oranda (>% 50) kadar yapabilirsiniz. On (biyodizel uygulamaları için örneğin) yağlı asit içeriğinin sadece ilgi ise, bir gravimetrik belirlenmesi kullanıldığı zaman, bu fazla tahmin edilecektir. Buna ek olarak, bir gravimetrik belirlenmesi ekstre lipidlerin tartmak için kullanılan analitik denge hassasiyeti kullanılması gereken örnek boyutunu belirler. Bu miktar genellikle kromatografisi kullanıldığında gereken miktarın çok daha fazladır. Son olarak, gravimetrik belirlenmesi üzerinde kromatografisi kullanmanın diğer bir avantajı kromatografisi yağ asidi bileşimi hakkında bilgi sağlamasıdır.

Bizim sunulan yöntemin bir başka alternatif doğrudan transesterifikasyon ^16,19,20 olduğunu.Bu yöntemde FAME lipid ekstraksiyonu ve yağlı asitlerin transesterifikasyon bir aşamada birleştirilir. Bu yöntem, ayrı bir çıkarma ve transesterifikasyon aşamasından daha hızlı, ancak şu adımları birleştirme ekstre için kullanılabilir çözücüler sınırlar. Bu olumsuz ekstraksiyon verimini etkileyebilir. Ayrı bir lipid ekstraksiyonu ve transesterifikasyon aşamasından bir başka avantajı, bu adımlardan ¹ arasında ek lipid sınıfı ayrılması için izin vermektedir. Doğrudan transesterifikasyon kullanıldığı zaman bu mümkün değildir.

Mikroalg lipid içeriğini belirlemek için yaygın olarak kullanılan diğer yöntemler, Nil gibi lipofilik floresan boyalar ile biyokütleyi boyama dahil kırmızı ya da BODIPY ve floresans sinyali ^21,22 ölçülmesi. Bu yöntemlerin bir avantajı, diğer yöntemlere göre daha az zahmetli olmasıdır. Bu yöntemlerin bir dezavantajı, floresan tepkisi, çeşitli nedenlerle, değişkendir, belli coğrafi arasında olmasıdıres, yetiştirme koşulları, lipit sınıfları, ve analitik prosedürler. Bir örnek olarak, bu varyasyonların birkaç mikroalg ile boya alımından farklılıklardan kaynaklanır. Başka bir nicel bir yöntem kullanılarak kalibrasyon bu nedenle tercihen tüm farklı yetiştirme koşulları ve büyüme aşamaları için gerçekleştirilen gereklidir. Son olarak, bu yöntem, yağ asidi bileşimi hakkında bilgi vermek ve kromatografi göre yöntemlerden daha az hassas ve tekrarlanabilir değildir.

Sunulan yöntem Lamers et al. ²³ ve Santos ve arkadaşları. ²⁴ tarafından tarif edilen yönteme göre ve aynı zamanda diğer çeşitli yazarlar tarafından ^1,25-27 uygulanmıştır. Ayrıca diğer yöntemler aynı ilkelere dayalı olduğunu mevcuttur ve benzer sonuçlar ^9,28 sağlayabilir.

Protokol

1.. Numune Hazırlama

1.1 ve 1.2 adımları gibi hazırlık dahil numune için iki alternatif protokolleri vardır. Her iki yöntem de eşit derecede uygundur ve benzer sonuçlar verir, fakat yosun kültür hacmi sınırlı bir miktarda mevcut ise, yöntem 1.1 önerilir.

NOT: Her iki protokol için, bütün protokole göre, iki ek boncuk döver tüpler hazırlamak ancak boş olarak kullanılmak üzere onlara yosun eklemeden. Bu şekilde, kullanılan malzemelerin bileşenlerin çıkması sonucu GC kromatogramda tepe noktaları belirlendi ve miktarları tayin edilebilir.

1.1. Numune Hazırlama Protokolü Seçenek 1: Önerilen zaman Yosun Kültür Sınırlı Miktarı Temin

1. Breuer ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi, örneğin, kültür et suyu içinde yosun kuru ağırlık konsantrasyonu (g / L) belirler. ^1..
2. 5-10 mg yosun kuru ağırlığı içeren bir kültür et suyunun hacmi aktarmabir cam santrifüj tüpü. 1.1.1 adımda belirlenen biyokütle konsantrasyonu kullanılarak transfer biyokütle tam miktarını hesaplayın.
3. 1200 x g santrifüj 5 dk.
4. Yüzer bir kısmını atın, tüp içinde, yaklaşık 0.25 ml bırakın.
5. Geri kalan süpernatan içinde yeniden askıya yosun yumuşak aşağı ve yukarı pipetlenerek pelet ve 200 ul, bir pipet kullanılarak boncuk dövme tüp için tam bir hücre pelletini aktarın.
6. ± 0.15 ml MilliQ su ile santrifüj tüpü ve cam pipet yıkayın ve aynı boncuk dövme tüpüne sıvının aktarın.
7. Hiçbir hava kabarcığı tüplerin alt kalması için en rpm'de bir dakika boyunca santrifüj tüpleri boncuk çırpıcı. Bu, -80 ° C de kapalı bir boncuk döver tüplerini muhafaza etmek mümkündür
8. Örneği içeren boncuk dövücü tüpleri liyofilize. Bu, -80 ° C de kapalı bir boncuk dövme tüplerini muhafaza etmek mümkündür

1.2. Numune Hazırlama Protokolü 2. Seçenek

1. Alg kültür suyu belirsiz bir hacmi Santrifüj ve süpernatant atın. Bu biyokütle konsantrasyonu belirlemek için veya kullanılan hacmini ölçmek için gerekli değildir.
2. Ölçüm veya kültür ortamı içinde mevcut olan ana tuzlarının konsantrasyonu kullanılarak kültür ortamının ozmolaritesini hesaplar.
3. Adım 1.2.1 kullanılan kültür ortamının ozmolaritesini yaklaşan bir amonyum format çözeltisinin, aynı hacimde hücre topağın tekrar askıda bırakılmasıyla hücre pelletini yıkayın. Bir equiosmolar amonyum format çözeltisi, hücrelerin yıkanması sırasında hücre lysis oluşumunu önler.

NOT: hücreleri yıkama kültür ortamı içinde mevcut tuzları çıkartmak için gereklidir. Bunun nedeni, bunların kültür ortamı içinde yüksek tuz konsantrasyonları deniz mikroalg yağlı asit analizi için özellikle önemlidir. Tuzlar hala mevcut olurdu, bu daha sonra t belirlenecektir hücre kuru ağırlığının miktarının overestimation neden olurOnun protokolü. Amonyum format bu Çözelti liyofilizasyon sırasında buharlaşmaya ve herhangi bir kalıntı bırakmaz çünkü hücreleri yıkamak için kullanılır.

4. Santrifüj alg süspansiyon ve atma yüzer.
5. Hücre pelletini liyofilize edilir.
6. Bir kordon çırpıcı tüp içine 5-10 mg liyofilize toz mikroalg tartılır. Tam ağırlığını kaydedin.

2. Hücre Parçalanması ve Lipid Ekstraksiyon

NOT: Bu bölümde geniş bir hücre parçalama prosedürü açıklanmaktadır. Muhtemelen, hücre bozulması bazı adımlar gereksiz ve az kapsamlı hücre parçalama bazı mikroalgler türler için veya belirli yetiştirme koşullarında elde biyokütle için aynı sonuçlar olabilir. Ancak bu her özel durum için doğrulama gerekir. Bu nedenle, önerilen geniş bir bozulma protokolü bütün mikroalg malzemesi için uygun olan evrensel bir yöntem olarak tavsiye edilir.

1. Tripentadecanoin kesin bir miktar (tr tartmakÜç C15 ihtiva eden iacylglycerol: 0 yağ asitleri) ve 04:05 (v / v) kloroform içinde bir tam olarak belli miktar ekleyin: metanol. Bu şekilde tripentadecanoin konsantrasyonu tam olarak bilinir. 50 mg / L'lik bir konsantrasyonda nişan Tripentadecanoin yağlı asit ölçümü için iç standart olarak hizmet vermektedir.
2. Ekle 1 ml kloroform: metanol 4:05 (h / h) (reaktiflere ve donanım tablosunda belirtilen) her bir dayak tüpe tripentadecanoin ihtiva etmektedir. Beadbeater tüpün kap içinde kalan herhangi bir boncuk olup olmadığını kontrol edin, bu boruların sızıntı neden olur. Çözücülerin doğru bir sıra için bir pozitif yer değiştirme pipet kullanın.
3. Boncuk boncuk çırpıcı tüpleri her dayaktan arasındaki iç bir 120 saniye ile 60 saniye boyunca 2,500 rpm'de her zaman 8x yendi.
4. Teflon uç vidalı kapaklar ile temiz ısıya dayanıklı bir 15 ml santrifüj tüpüne cam boncuk dövme tüplerden çözüm aktarın. Yanı sıra boncuk çırpıcı tüpten tüm boncuklar aktarmak için emin olun.
5. Olduğu için,h boncuk çırpıcı boru eklemek, 1 ml kloroform: metanol 04:05 (v / v) boncuk çırpıcı tüp, kap ve yakın karıştırın ve aşama 2.4 'ten aynı cam tüp, bu çözelti içine aktarmak tripentadecanoin ihtiva etmektedir. (Kloroform içinde toplam 4 ml: metanol 04:05 (v / v) ihtiva eden tripentadecanoin numune başına kullanılmıştır - Adım 2.2 'de ilave edildi, 1 ml ile 3 yıkama işlemi boyunca 3 ml) tüpü üç kez yıkayın.
6. Vortex cam, 10 dakika boyunca bir sonikasyon banyosu içinde 5 saniye ve sonikasyon için borular.
7. 50 mM ihtiva eden 2.5 ml MilliQ su ekleyin 2-amino-2-hidroksimetil-propan-1 ,3-diol (Tris) ve bir HCI çözeltisi kullanılarak pH 7'ye ayarlanır 1 M NaCl,. Su: Bu, kloroform ve metanol arasında bir faz ayrılmasına neden olur. 1 M NaCl kloroform fazının doğru lipidlerin dengeyi arttırmak için kullanılır.
8. Daha sonra 5 saniye vorteksleyin ve 10 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır.
9. 1.200 x g, 5 dakika boyunca santrifüj.
10. Bir cam Pasteur pipett kullanarak temiz bir cam tüpe tüm kloroform fazı (alt faz) aktarıne. Herhangi interfazda veya üst faz aktarmak için değil emin olun.
11. (: Su solüsyonu metanol ihtiva eden), eski tüp için 1 ml kloroform ilave edilerek örnek ayıklamak yeniden.
12. Daha sonra 5 saniye vorteksleyin ve 10 dakika boyunca ultrasonik titremeye maruz bırakılır.
13. 1.200 x g, 5 dakika boyunca santrifüj.
14. Adım 2.10 ilk kloroform fraksiyonu ile bir cam Pasteur pipet kullanılarak ve havuz kloroform fazı (alt faz) toplayın.
15. Zorluklar önceki adımda tüm kloroform fraksiyonunun deneyimli tekrarlayın 2,11-2,14 adımları. Aksi takdirde aşama 2.16 ile devam edin.
16. Bir azot gazı akımı içinde tüpten kloroform buharlaştırın. Bu adım, numuneler bir azot gazı atmosferi altında -20 ° C'de saklanabilir sonra.

3. Yağlı asit metil esterleri ile transesterifikasyon

1. Kurutulmuş ekstrakt lipitleri (tüp ilk olarak kloroform fraksiyonu ihtiva eder) ihtiva eden bir tüpe% 5 ihtiva eden 3 mi metanol (v / v) sülfürik asit eklenir vetüpü sıkıca kapatın.
2. 5 saniye için Vortex.
3. Bir blok ısıtıcı ya da su banyosu içerisinde 70 ° C'de 3 saat boyunca inkübe edin. Periyodik (Her ± 30 dk) emin olun numuneler kaynar (bir yanlış kapağı kapalı kaynaklanan) ve vorteks tüpler değildir. Bu reaksiyon sırasında, yağ asitlerin, yağlı asit metil esterleri (FAME) için metile edilir.
4. Soğuk, oda sıcaklığına kadar örnekler ve 3 ml MilliQ su ve 3 ml n-heksan ilave edin.
5. 5 saniye vorteksleyin ve test tüpü rotatifine ile 15 dakika boyunca karıştırın.
6. 1.200 x g, 5 dakika boyunca santrifüj.
7. 2 hekzan (üst) faz ml ve bir cam Pasteur pipeti kullanarak taze cam tüp koymak toplayın.
8. Yıkamak için toplanan heksan faza 2 ml MilliQ su ekleyin.
9. 1.200 x g, 5 dakika boyunca 5 saniye ve santrifüj vorteksleyin. Bu adımdan sonra azot gazı atmosferi (gerekli değildir faz ayrımı) altında -20 ° C'de örnekleri saklamak mümkündür.

4. Fames U KantitasyonuSing Gaz Kromatografi

1. , Bir cam Pasteur pipet kullanılarak heksan faz (üst faz) ile GC şişe doldurun.
2. GC şişelerdeki kapakları yerleştirin. Flakon buharlaşmayı önlemek için, kapaklar tamamen kapatılır ve açılamaz emin olun.
3. GC yıkama çözücüler (hekzan) doldurun, atık şişeleri boşaltın, ve oto-örnekleyici numune şişeleri koymak. GC, ilk çalıştırma GC sadece hekzan içeren 2 boşluklar üzerinde gerçek örnekleri çalıştırmadan önce.
4. Bir Nukol kolonu (0.53 mm x 1.0 um, 30 x) ile birlikte, bir GC-FID ile ilgili örnekleri çalıştırın. 250 ° C'lik giriş sıcaklığı kullanarak ve taşıyıcı gaz, 81.7 kPa basıncı ve 0.1:1 arasında bölünmüş oranı, toplam akış hızı olarak helyum kullanın: 20 ml / dak. 40 ml / dk 'lık akış oranında ₂ H, 400 ml / dak hava akış oranı ve O, 9.3 ml / dk akış oranı ile 270 ° C'lik FID detektörü sıcaklığı. 1 ul / numune enjeksiyon hacmi için ayarlayın. N-hekzan ile öncesi ve sonrası yıkama enjektör. Başlangıç ​​fırın sıcaklığı 0.5 dakika boyunca 90 ° C olarak ayarlanmış ve daha sonra wit yükseltilirh 20 ° C / dak, 200 ° C'lik bir fırın sıcaklığına kadar ulaşılır. Fırın sıcaklığı, daha sonra 39 dakika boyunca 200 ° C 'de muhafaza edilir. Toplam çalışma süresi 45 dk.

Sonuçlar

Bu işlem ile elde edilen tipik bir kromatogramı, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Fames Kullanılan GC kolon ve protokolü ile boyut ve doyma derecesi ile ayrılır. Kısa zincirli yağ asitleri ve uzunluğu daha fazla doymuş yağlı asitler (daha az çift bağlar) daha kısa tutma süresine sahip. Kullanılan GC kolon ve protokol yağ asidi izomerleri (aynı zincir uzunluğu ve doygunluk derecesi, ancak çift bağların farklı pozisyonlar) ayırmak niyetinde değilim, ama bu farklı bir GC sütun...

Tartışmalar

Tarif edilen yöntem olup, içeriğinin belirlenmesi hem de mikroalg biyokütle içinde mevcut toplam yağ asitlerinin bileşim için kullanılabilir. Depolama (TAG) da dahil olmak üzere hem de membran lipitleri (fosfolipidler ve glikolipidler) tüm lipit sınıfları, elde edilen yağ asitleri, tespit edilir. Mikroalg mevcut doygunluk her yağlı asit zincir uzunlukları ve dereceleri tespit ve ayırt edilebilir. Yöntem, mekanik hücre bozulması, solvent bazlı lipid ekstraksiyonu, FAME yağlı asitlerin esterlenmes...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent and equipment	Company	Catalogue number	Comments (optional)
tripentadecanoin (C15:0 TAG)	Sigma Aldrich	T4257	CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Larodan
Beadbeater	Bertin Technologies	Precellys 24
beadbeater tubes	MP Biomedicals	Lysing matrix E 116914500
GC-FID	Hewlett-Packer	HP6871
GC column	Supelco	Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl	Mettler Toledo	MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000	Mettler Toledo	C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml	VWR	612-1925
glass tubes	VWR	SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000	VWR	SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps	VWR	SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator	VWR	445-2101
Heated Evaporator/Concentrator	Cole-Parmer	YO-28690-25