Analyse de la teneur en acide gras et de la composition en microalgues

Résumé

Procédé pour la détermination de la teneur en acides gras et de la composition en micro-algues sur la base de la rupture mécanique des cellules, le solvant d'extraction à base de lipide, de transestérification, et la quantification et l'identification des acides gras par chromatographie en phase gazeuse est décrit. Un étalon interne tripentadecanoin est utilisé pour compenser les pertes possibles lors de l'extraction et de transestérification incomplète.

Résumé

Procédé pour déterminer la teneur et la composition des acides gras totaux présents dans les micro-algues est décrit. Les acides gras sont un constituant majeur de la biomasse de microalgues. Ces acides gras peuvent être présents dans différentes classes d'acyl-lipide. En particulier, les acides gras présents dans triacylglycérols (TAG) sont d'un intérêt commercial, car ils peuvent être utilisés pour la production de carburants de transport, les produits chimiques en vrac, des nutraceutiques (ω-3 acides gras), et les produits alimentaires. Pour développer des applications commerciales, les méthodes analytiques permettant la quantification de la teneur en acide gras et de la composition sont nécessaires. Les microalgues sont des cellules individuelles entourées par une paroi cellulaire rigide. Procédé d'analyse d'acide gras doit fournir suffisamment de rupture des cellules pour libérer tous les lipides d'acyle et la procédure d'extraction utilisée doit être capable d'extraire toutes les classes de lipides acyle.

Avec la méthode présentée ici tous les acides gras présents dans les microalgues peuvent être précise et reproductible idenTIFIÉ et quantifiés à l'aide de petites quantités d'échantillon (5 mg), indépendamment de leur longueur de chaîne, le degré d'insaturation, ou la classe de lipides, ils font partie.

Ce procédé ne fournit pas d'informations sur l'abondance relative des différentes classes de lipides, mais peut être étendu à séparer les classes de lipides de l'autre.

La méthode est basée sur une séquence de rupture mécanique des cellules, l'extraction par solvant à base de lipide, la transestérification des acides gras en esters gras méthyliques d'acide (FAME), et la quantification et l'identification de FAME à l'aide de Chromatographie en phase gazeuse (GC-FID). Un étalon interne de TAG (tripentadecanoin) est ajouté avant le procédé d'analyse pour corriger les pertes au cours de l'extraction et de transestérification incomplète.

Introduction

Les acides gras sont un des principaux constituants de la biomasse de microalgues et de faire généralement entre 5-50% du poids sec des cellules ^1-3. Ils sont principalement présents sous la forme de glycérolipides. Ces glycérolipides à son tour principalement constitués de phospholipides, des glycolipides et triglycérides (TAG). En particulier, les acides gras présents dans le TAG sont d'intérêt commercial, car ils peuvent être utilisés comme une ressource pour la production de carburants de transport, les produits chimiques en vrac, des nutraceutiques (ω-3 acides gras), et les produits alimentaires ^3-6. Microalgues peuvent croître dans des milieux de culture à base d'eau de mer, peut avoir une productivité de surface beaucoup plus élevé que les plantes terrestres, et peut être cultivé dans des photobioréacteurs à des endroits qui sont impropres à l'agriculture, peut-être même à l'étranger. Pour ces raisons, les microalgues sont souvent considérés comme une alternative prometteuse pour les plantes terrestres pour la production de biodiesel et d'autres produits en vrac ^3-6. Potentiellement pas l agricoleet ou d'eau douce (lorsqu'elles sont cultivées dans des photobioréacteurs fermés ou quand microalgues marines sont utilisés) est nécessaire pour leur production. Par conséquent, les biocarburants dérivés de microalgues sont considérées comme 3 ^ème génération de biocarburants.

Le contenu cellulaire total en acides gras (% du poids sec), la composition de la classe de lipides, ainsi que la longueur de l'acide gras et le degré de saturation sont très variables selon les espèces de microalgues. En outre, ces propriétés varient avec les conditions de culture telles que la disponibilité des nutriments, la température, le pH, l'intensité lumineuse et ^1,2. Par exemple, lorsqu'ils sont exposés à la privation d'azote, de micro-algues peuvent accumuler de grandes quantités de TAG. Dans des conditions de croissance optimales TAG constitue généralement moins de 2% du poids sec, mais lorsqu'ils sont exposés à la famine azote contenu de TAG peut augmenter jusqu'à 40% du poids sec des microalgues ^1.

Les microalgues produisent principalement des acides gras à chaîne longue de 16 à 18atomes de carbone, mais certaines espèces peuvent apporter des acides gras allant jusqu'à 24 atomes de carbone en longueur. Les deux saturé ainsi que les acides gras hautement insaturés sont produits par des micro-algues. Ces derniers comprennent les acides gras avec des avantages nutritionnels (ω-3 acides gras) comme C20: 5 (acide eicosapentaénoïque, EPA) et C22: 6 (acide docosahexaénoïque, DHA) pour lesquels aucune solution de rechange végétales existent ^1,2,4,7. Le (la distribution de) l'acide gras de longueur de chaîne et du degré de saturation détermine également les propriétés et la qualité des biocarburants d'algues dérivés et les huiles comestibles ^4,8.

Pour développer des applications commerciales de microalgues dérivés des acides gras, des méthodes d'analyse fiables pour la quantification de la teneur en acides gras et la composition sont nécessaires.

Comme l'a également souligné Ryckebosch et al. ^9, l'analyse des acides gras dans les microalgues se distingue des autres substrats (par exemple l'huile végétale, les produits alimentaires, les tissus d'animaux, etc) êtreprovoquer 1) microalgues sont des cellules individuelles entourées de parois cellulaires rigides, ce qui complique l'extraction des lipides; 2) microalgues contiennent une grande variété de classes de lipides et la distribution de la classe de lipides est très variable ^7. Ces différentes classes de lipides ont une grande variété dans la structure chimique et des propriétés telles que la polarité. En outre, les classes de lipides autres que les lipides acyle sont produites, 3) contient des micro-algues d'une grande variété d'acides gras, variant de 12 à 24 atomes de carbone de longueur et contenant à la fois saturés ainsi que des acides gras hautement insaturés. Par conséquent, les méthodes mises au point pour analyser les acides gras dans les substrats autres que les micro-algues, pourrait ne pas être approprié pour analyser les acides gras dans les microalgues.

Comme examiné par Ryckebosch et al. ^9, la principale différence entre les procédures d'extraction des lipides couramment utilisés dans les solvants est-systèmes qui sont utilisés. En raison de la grande variété de classes de lipides présents dans les microalgues, chacun variant de polarité, la extraitla quantité de lipides peut varier selon les solvants utilisés ^{10 à 12.} Cela conduit à des incohérences dans le contenu lipidique et la composition présentée dans la littérature ^9,10. En fonction du système de solvants utilisé, les méthodes basées sur l'extraction par solvant, sans rupture des cellules par le biais, par exemple, les battements de bourrelet ou sonication, risquent de ne pas extraire l'ensemble des lipides en raison de la structure rigide de certaines espèces de microalgues ^9,13. Dans le cas de l'extraction des lipides incomplète, l'efficacité de l'extraction des différentes classes de lipides peut varier ^14. Cela peut aussi avoir un effet sur ​​la composition en acides gras mesurée, car la composition en acides gras est variable entre les classes de lipides ^7.

Notre procédé est basé sur une séquence de rupture mécanique des cellules, l'extraction par solvant à base de lipide, la transestérification des acides gras en esters gras méthyliques d'acide (FAME), et la quantification et l'identification de FAME à l'aide de Chromatographie en phase gazeuse en combinaison avec une ionisation de flammedétecteur de tion (GC-FID). Un étalon interne sous la forme d'un triacylglycérol (tripentadecanoin) est ajouté avant le procédé d'analyse. Les pertes éventuelles lors de l'extraction et de transestérification incomplète peuvent alors être corrigées pour. La méthode peut être utilisée pour déterminer le contenu ainsi que la composition des acides gras présents dans la biomasse de micro-algues. Tous les acides gras présents dans les différentes classes d'acyl-lipide, y compris le stockage (TAG), ainsi que des lipides membranaires (les glycolipides, phospholipides), sont détectés, identifiés et quantifiés avec précision et de façon reproductible par ce procédé en utilisant uniquement des petites quantités d'échantillon (5 mg) . Cette méthode ne fournit pas d'informations sur l'abondance relative des différentes classes de lipides. Cependant, le procédé peut être étendu à séparer les classes de lipides de l'autre ^1. La composition des différentes classes de lipides et de la concentration de l'acide gras peut ensuite être déterminée individuellement.

Dans la littérature plusieurs autres méthodes sontdécrit à analyser les lipides dans les microalgues. Certaines méthodes sont axées sur le total des composants lipophiles ^15, alors que d'autres méthodes sont axées sur les acides gras totaux ^9,16. Ces solutions comprennent détermination gravimétrique des lipides totaux extraits, trans-estérification directe des acides gras combinés à la quantification en utilisant la Chromatographie, et cellules présentant une coloration avec des colorants fluorescents lipophiles.

Une solution couramment utilisée pour la quantification des acides gras par chromatographie est la quantification des lipides en utilisant une détermination gravimétrique ^17,18. Avantages d'une détermination gravimétrique sont l'absence d'exigences pour l'équipement de pointe et coûteux comme un chromatographe en phase gazeuse; facilité à mettre en place la procédure, en raison de la disponibilité de l'équipement analytique standardisée (par exemple Soxhlet), et une détermination gravimétrique est moins de temps que Chromatographie méthodes fondées. L'avantage majeur de l'utilisation des méthodes de chromatographie sur la base de l'OTHer main est que, dans un tel procédé que les acides gras sont mesurés. Dans une détermination gravimétrique de l'acide non gras contenant des lipides, comme des pigments ou des stéroïdes, sont également inclus dans la détermination. Ces acides gras non-contenant des lipides peuvent constituer une part importante (> 50%) des lipides totaux. Si l'on ne s'intéresse qu'à la teneur en acide gras (par exemple pour des applications de biodiesel), il sera surestimée quand une détermination gravimétrique est utilisé. En outre, dans une détermination gravimétrique de la précision de la balance analytique utilisée pour peser les lipides extraits détermine la taille de l'échantillon qui doit être utilisé. Cette quantité est généralement beaucoup plus que la quantité nécessaire lorsque la Chromatographie est utilisée. Enfin, un autre avantage de l'utilisation de la Chromatographie sur détermination gravimétrique est que la Chromatographie fournit des informations sur la composition en acides gras.

Une autre alternative à notre méthode présentée est ^16,19,20 de transestérification directe.Dans ce procédé, l'extraction des lipides et la transestérification des acides gras à FAMEs sont combinées en une seule étape. Cette méthode est plus rapide que l'extraction d'une étape séparée et la transestérification, mais la combinaison de ces étapes limite les solvants qui peuvent être utilisés pour l'extraction. Cela pourrait influencer négativement l'efficacité de l'extraction. Un autre avantage d'une extraction des lipides et la transestérification étape séparée est qu'il permet une séparation des classes de lipides supplémentaire entre les étapes ^1. Ceci n'est pas possible lorsque la transestérification directe est utilisé.

D'autres méthodes couramment utilisées pour déterminer la teneur en lipides des microalgues sont coloration de la biomasse avec des taches fluorescentes lipophiles tels que le Nil rouge ou BODIPY et mesurer le signal de fluorescence ^21,22. Un avantage de ces méthodes est qu'elles sont moins laborieux que les procédés alternatifs. Un inconvénient de ces méthodes est que la réponse fluorescente est, pour diverses raisons, variable entre spécies, les conditions de culture, les classes de lipides, et des procédures analytiques. A titre d'exemple, plusieurs de ces variations sont causées par des différences dans l'absorption du colorant par les micro-algues. L'étalonnage en utilisant une autre méthode quantitative est donc nécessaire, de préférence effectuée pour toutes les différentes conditions de culture et les stades de croissance. Enfin, cette méthode ne fournit pas d'informations sur la composition en acides gras et est moins précise et reproductible que les méthodes de chromatographie en fonction.

La méthode présentée est basée sur la méthode décrite par Lamers et al. ²³ et Santos et al. ²⁴ et a également été appliquée par d'autres auteurs ^1,25-27. Également d'autres méthodes sont disponibles qui sont basés sur les mêmes principes et pourraient fournir des résultats similaires ^9,28.

Protocole

Une. Préparation de l'échantillon

Il existe deux protocoles alternatifs pour la préparation des échantillons inclus que les étapes 1.1 et 1.2. Ces deux méthodes conviennent également et donnent des résultats similaires, mais si une quantité limitée de volume de culture d'algues est disponible, méthode 1.1 est recommandée.

REMARQUE: Pour deux protocoles, préparer deux tubes perle de battage supplémentaires selon le protocole entier, mais sans ajouter les algues à eux pour être utilisé comme un vide. De cette manière, les pics dans le chromatogramme de CPG résultant de l'extraction de composants à partir de matériaux utilisés peuvent être identifiées et quantifiées.

1.1. Exemple de protocole Préparation Option 1: Recommandé Quand une quantité limitée d'algues Culture est disponible

1. Déterminer la concentration en poids sec d'algues (g / L) dans le bouillon de culture, par exemple comme décrit par Breuer et al. ^1.
2. Transférer un volume de bouillon de culture qui contient de 5 à 10 mg de poids sec d'algues àun tube de centrifugation en verre. Calculer le montant exact de la biomasse transférée en utilisant la concentration de la biomasse déterminée à l'étape 1.1.1.
3. Centrifugeuse 5 min à 1200 x g.
4. Retirez la partie du surnageant, laisser environ 0,25 ml dans le tube.
5. Re-suspendre l'algue dans le surnageant restant par pipetage doux le culot vers le haut et vers le bas et transférer le culot cellulaire complète à un tube de battage de talon en utilisant une pipette de 200 ul.
6. Rincer le tube de centrifugeuse et la pipette en verre avec de l'eau de ± 0,15 ml et transférer le liquide dans le même tube de battage de talon.
7. Tubes Centrifugeuse perle de batteur pour une minute à vitesse de rotation maximale pour s'assurer qu'aucune bulle d'air dans le fond des tubes. Il est possible de stocker des tubes perle de batteur fermés à -80 ° C.
8. Lyophiliser les tubes perle de batteur contenant l'échantillon. Il est possible de stocker les tubes perle de batteur fermés à -80 ° C.

1.2. Exemple de l'option Protocole Préparation 2

1. Centrifuger un volume indéterminé de bouillon de culture d'algues et éliminer le surnageant. Il n'est pas nécessaire de déterminer la concentration de la biomasse ou à mesurer le volume utilisé.
2. Mesurer ou calculer l'osmolarité du milieu de culture en utilisant la concentration des principaux sels présents dans le milieu de culture.
3. Laver le culot cellulaire en remettant en suspension le culot cellulaire dans le même volume, tel qu'il est utilisé dans l'étape 1.2.1, d'une solution de formiate d'ammonium, qui se rapproche de l'osmolarité du milieu de culture. Une solution de formiate d'ammonium equiosmolar empêche lyses cellulaires au cours du lavage des cellules.

NOTE: Le lavage des cellules est nécessaire pour éliminer les sels présents dans le milieu de culture. Ceci est particulièrement important pour l'analyse des acides gras dans les micro-algues marines en raison des concentrations élevées de sel dans leur milieu de culture. Si sels seraient encore présents, cela causerait une surestimation de la quantité de poids sec des cellules qui sera déterminé plus tard dans tson protocole. formate d'ammonium est utilisé pour laver les cellules car cette solution complètement s'évaporer lors de la lyophilisation et ne laisse aucun résidu.

4. Centrifugeuse algues suspension et éliminer le surnageant.
5. Lyophiliser le culot cellulaire.
6. Peser 5 à 10 mg de poudre lyophilisée de microalgues dans un tube de battage de talon. Noter le poids exact.

2. Cellule de perturbation et extraction des lipides

NOTE: Cette section décrit une vaste procédure de rupture des cellules. Peut-être, certaines des mesures de perturbation de la cellule sont redondantes et moins vaste perturbation cellulaire pourrait obtenir les mêmes résultats pour certaines espèces de microalgues ou de la biomasse provenant de certaines conditions de culture. Ce devrait validation pour chaque situation spécifique cependant. Par conséquent, la vaste protocole de perturbation proposée est recommandé comme une méthode universelle convient à tout le matériel de micro-algues.

1. Peser une quantité exacte de tripentadecanoin (triacylglycerol contenant trois C15: 0 acides gras) et l'ajouter à une quantité exactement connue 4:5 (v / v) de chloroforme: méthanol. De cette façon, la concentration de tripentadecanoin est exactement connue. Objectif pour une concentration de 50 mg / L. Tripentadecanoin sert d'étalon interne pour la quantification des acides gras.
2. Ajouter 1 ml de chloroforme: méthanol 04:05 (v / v) contenant tripentadecanoin à chaque tube de battage (spécifié dans les réactifs et tableau des équipements). Vérifiez qu'il n'y a pas de perles restantes à l'intérieur du capuchon du tube de BeadBeater, cela se traduira par une fuite des tubes. Utiliser une pipette volumétrique pour plus précise de solvants.
3. Perle battre les tubes perle de batteur 8x à 2500 tours par minute pendant 60 secondes, chaque fois avec un 120 sec interne entre chaque battement.
4. Transférer la solution des tubes perle de batteur à 15 ml tube de centrifugation en verre résistant à la chaleur propre avec insert en Téflon capsules à vis. Assurez-vous de transférer toutes les perles du tube de battage de perles ainsi.
5. Pour n'étaith le tube de battage de talon, ajouter 1 ml de chloroforme: methanol 04:05 (v / v) contenant tripentadecanoin dans le tube de battage de talon, à proximité capuchon et mélanger, et transférer cette solution sur le même tube de verre provenant de l'étape 2.4. Laver le tube trois fois (au total 4 ml de chloroforme: méthanol 04:05 (v / v) contenant tripentadecanoin est utilisé par échantillon - 1 ml ajoutés à l'étape 2.2 et 3 ml pour 3 étapes de lavage).
6. Vortex les tubes en verre pour 5 s et de traitement par ultrasons dans un bain de sonication pendant 10 min.
7. Ajouter 2,5 ml d'eau MilliQ, contenant 50 mM de 2-amino-2-hydroxyméthyl-propane-1 ,3-diol (Tris) et 1 M de NaCl, qui est réglée à un pH de 7 en utilisant une solution de HCl. Cela entraînera une séparation de phases entre du chloroforme et de méthanol: eau. 1 M de NaCl est utilisé pour améliorer l'équilibre des lipides vers la phase de chloroforme.
8. Vortex pendant 5 secondes, puis sonication pendant 10 min.
9. Centrifuger pendant 5 minutes à 1200 x g.
10. Transférer la phase chloroformique à l'(phase inférieure) dans un tube en verre propre en utilisant un pipett Pasteur en verree. Assurez-vous de ne pas transférer tout ou interphase phase supérieure.
11. Ré-extraire l'échantillon en ajoutant 1 ml de chloroforme à ancien tube (contenant le méthanol: solution d'eau).
12. Vortex pendant 5 secondes, puis sonication pendant 10 min.
13. Centrifuger pendant 5 minutes à 1200 x g.
14. Recueillir la phase de chloroforme (phase inférieure) en utilisant une pipette Pasteur et la piscine de verre avec la première fraction chloroformique de l'étape 2.10.
15. Si des difficultés sont expérimentés dans la collecte de la fraction chloroforme ensemble à l'étape précédente, répétez les étapes 2.11 à 2.14. Sinon, passez à l'étape 2.16.
16. On évapore le chloroforme à partir du tube dans un courant d'azote gazeux. Après cette étape, les échantillons peuvent être conservés à -20 ° C sous une atmosphère d'azote gazeux.

3. Transestérification pour esters méthyliques d'acides gras

1. Ajouter 3 ml de methanol contenant 5% (v / v) d'acide sulfurique dans le tube contenant les lipides extraits secs (tubes contenant l'origine de la fraction chloroforme) etfermer hermétiquement le tube.
2. Vortex pendant 5 sec.
3. Incuber les échantillons pendant 3 heures à 70 ° C dans un bloc chauffant ou un bain d'eau. Périodiquement (tous les ± 30 min) veiller à ce que les échantillons ne sont pas en ébullition (causée par un couvercle mal fermé) et les tubes vortex. Au cours de cette réaction sont des acides gras méthylés de leurs esters méthyliques d'acides gras (FAME).
4. Échantillons refroidir à température ambiante et ajouter 3 ml eau MilliQ et 3 ml de n-hexane.
5. Vortex pendant 5 secondes et on mélange pendant 15 min avec un rotateur pour tubes à essais.
6. Centrifuger pendant 5 minutes à 1200 x g.
7. Recueillir 2 ml de la phase hexane (en haut) et mettre dans un tube de verre frais en utilisant une pipette Pasteur en verre.
8. Ajouter l'eau de 2 ml de la phase d'hexane recueillies à laver.
9. Vortex pendant 5 secondes et centrifuger pendant 5 min à 1200 x g. Après cette étape, il est possible de conserver les échantillons à -20 ° C sous atmosphère d'azote gazeux (de séparation de phase n'est pas nécessaire).

4. Quantification des FAMEs Uchantent chromatographie en phase gazeuse

1. Remplir des flacons en GC de la phase d'hexane (phase supérieure) à l'aide d'une pipette Pasteur en verre.
2. Placez les bouchons sur les flacons de GC. Assurez-vous que les bouchons sont complètement scellés, et ne peuvent pas être transformés, pour éviter l'évaporation de la fiole.
3. Remplir les solvants de lavage de GC (hexane), vider les flacons de déchets, et de mettre en flacons d'échantillon échantillonneur automatique. Avant d'exécuter les échantillons réels sur le GC, première manche 2 blancs ne contenant que de l'hexane sur le GC.
4. Analyser les échantillons avec un GC-FID avec une colonne Nukol (30 mx 0,53 mm x 1,0 um). Utilisez la température d'entrée de 250 ° C et utiliser de l'hélium comme gaz porteur, la pression de 81,7 kPa et rapport de division de 0,1:1, débit total: 20 ml / min. Température du détecteur FID à 270 ° C avec H ₂ débit de 40 ml / min, débit de 400 ml / min de débit d'air et il taux de 9,3 ml / min de débit. Régler le volume d'injection de 1 pl / échantillon. Avant et après lavage injecteur avec du n-hexane. Température initiale du four est réglé à 90 ° C pendant 0,5 min et ensuite soulevé l'esprith 20 ° C / min jusqu'à une température de four de 200 ° C soit atteinte. La température du four est ensuite maintenue à 200 ° C pendant 39 min. Une durée totale est de 45 min.

Résultats

Un chromatogramme typique que l'on obtient via ce procédé est présenté sur la figure 1. FAME sont séparés par taille et le degré de saturation par la colonne de GC et le protocole utilisé. Plus courtes longueurs d'acides gras à chaîne et d'acides gras saturés (plus moins de doubles liaisons) ont des temps de rétention. La colonne de CPG utilisée protocole et n'ont pas l'intention de séparer les isomères d'acides gras (même longueur de chaîne et le degré de satur...

Discussion

Le procédé décrit peut être utilisé pour déterminer le contenu ainsi que la composition des acides gras totaux présents dans la biomasse de micro-algues. Les acides gras dérivés de toutes les classes de lipides, y compris le stockage (TAG), ainsi que des lipides membranaires (phospholipides et glycolipides), sont détectés. Toutes les longueurs de chaîne d'acides gras et les degrés de saturation qui sont présentes dans les micro-algues peuvent être détectées et distinguées. La méthode est basée su...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
tripentadecanoin (C15:0 TAG)	Sigma Aldrich	T4257	CAS Number 7370-46-9
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Sigma Aldrich
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Lipidox
TAG or FAME standards of all fatty acids expected in sample	Larodan
Beadbeater	Bertin Technologies	Precellys 24
beadbeater tubes	MP Biomedicals	Lysing matrix E 116914500
GC-FID	Hewlett-Packer	HP6871
GC column	Supelco	Nukol 25357
Positive displacement pipette 100-1000μl	Mettler Toledo	MR-1000
Positive displacement pipet tips C-1000	Mettler Toledo	C-1000
Pipetvuller, Pi-Pump 2 ml	VWR	612-1925
glass tubes	VWR	SCERE5100160011G1
TUBE 16 X 100 MM BOROSILICATE 5.1 1 * 1.000	VWR	SCERE5100160011G1
Teflon coated screw-caps	VWR	SCERKSSR15415BY10
STUART SCIENTIFIC SB2 test tube rotator	VWR	445-2101
Heated Evaporator/Concentrator	Cole-Parmer	YO-28690-25