La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

Resumen

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4⁺CD45RB^high T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Resumen

Hay muchos modelos diferentes de animales disponibles para el estudio de la patogénesis de las enfermedades humanas inflamatorias del intestino (IBD), cada uno con sus propias ventajas y desventajas. Se describe aquí un modelo de colitis experimental que se inicia por la transferencia adoptiva de células ^{de alta} T CD4 ⁺ CD45RB singeneicos bazo en ratones receptores deficientes de células T y B. La población de células ^{de alta} T CD4 ⁺ CD45RB que consiste en gran parte de las células efectoras no tratados previamente es capaz de inducir la inflamación intestinal crónica, muy parecidas a aspectos clave de la EII humana. Este método puede ser manipulado para estudiar aspectos de la aparición de la enfermedad y la progresión. Además, puede ser utilizado para estudiar la función de innato y adaptativo, y las poblaciones de células inmunes reguladoras, y el papel de la exposición ambiental, es decir, la microbiota, en la inflamación intestinal. En este artículo se expone la metodología para la inducción de la colitis con un protocolo paso a paso. Esta incLudes un video de demostración de los aspectos técnicos clave necesarios para desarrollar con éxito este modelo murino de colitis experimental con fines de investigación.

Introducción

The inflammatory bowel diseases (IBD) Crohn’s disease and ulcerative colitis result from an incompletely defined and complex interaction between host immune responses, genetic susceptibility, environmental factors, and the enteric luminal contents¹. Recent genome-wide association studies report associations between immune cell regulatory genes and IBD susceptibility^2,3. Both innate and adaptive immune cell intrinsic genes are represented in these studies, indicating a central role for these cell populations in IBD pathogenesis.

There currently exist more than 50 animal models of human IBD. While no one model perfectly phenocopies human IBD, many are useful for studying various aspects of human disease, including disease onset and progression and the wound-healing response. In the method described here, intestinal inflammation is initiated with syngeneic splenic CD4⁺CD45RB^high T cell adoptive transfer into T and B cell deficient recipient mice⁴. The CD4⁺CD45RB^high T cell population contains mainly naïve T cells primed for activation that are capable of inducing chronic small bowel and colonic inflammation. This method allows the researcher to modify key experimental variables, including both innate and adaptive immune cell populations, to answer biologically relevant questions relating to disease pathogenesis. Additionally, this method provides precise initiation of disease onset and a well-characterized experimental time course. This permits the kinetic study of clinical features of disease progression in mice. Intestinal inflammation induced by this method shares many features with human IBD, including chronic large and small bowel transmural inflammation, pathogenesis driven by cytokines such as TNF and IL-12, and systemic symptoms such as wasting⁵. Thus, it is an ideal model system for studying the pathogenesis of human IBD.

The method here describes in detail the protocol for inducing experimental colitis by adoptive transfer of CD4⁺CD45RB^high T cells into Rag1^-/- mice. We discuss key technical steps, expected results, optimization, and trouble-shooting. We address the required elements for the successful development of this murine model of intestinal inflammation for research purposes.

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Protocolo

NOTA: Asegúrese de que todos los animales protocolos son aprobados por y en cumplimiento con el empleo Comisión (IACUC) regulaciones Institucional Cuidado de Animales y el y el Manual del Consejo Nacional de Investigación para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Los ratones donantes pueden ser ya sea hombre o mujer, pero los ratones receptores deben ser hombres. Si hembras receptoras se van a utilizar, los ratones donantes deben ser mujeres ^5. Mantener colonias utilizando, ropa de cama no estéril y agua regulares no acidificado, porque éstos pueden afectar la microbiota intestinal y, por lo tanto, el fenotipo colitis de los ratones ^5,6.

1. Preparación Experimental

1. Utilice los medios y tampones heladas. Mantener células en hielo durante todo el experimento.
2. Lleve a cabo el experimento en campana de bioseguridad estéril utilizando una técnica estéril.

2. Aislamiento de células T esplénica

1. La eutanasia de ratón donante / ratones en CO ₂ cámara seguidos por dislocatio cervicaln. Pulverizar abdomen con etanol al 70%.
2. Haga una incisión horizontal en el abdomen y pelar la piel para exponer peritoneo. Mantenga peritoneo fuera de los órganos internos con los fórceps y hacer una incisión en el peritoneo abdominal izquierda para exponer y extirpar el bazo.
3. Coloque el bazo en 10 ml de medios completos en un plato de Petri. Retire y deseche el exceso de tejido de bazo.
4. Utilice 2 portaobjetos de vidrio esterilizados para aplastar y desmenuzar el bazo en la suspensión de una sola célula. Suspensión de células Filtrar a través de un colador de 70 micras en un tubo cónico de 50 ml y enjuague filtro con 5 ml de medios completos. Coloque un máximo de 5 bazos en un tubo cónico de 50 ml.
5. Centrifugar las células a 450 xg durante 7 minutos. Desechar el sobrenadante vertiendo o por succión al vacío en un contenedor de residuos.
6. Resuspender suavemente las células en 5 ml por bazo de tampón de lisis para lisar las células rojas de la sangre durante 10 min a temperatura ambiente. Añadir un volumen igual de completa Media (5 ml por bazo) en el tubo.
7. centrifugar las células a 450 xg durante 7 minutos. Desechar el sobrenadante vertiendo o por succión al vacío en un contenedor de residuos.
8. Resuspender las células en 10 ml de Etiquetado Buffer.
9. Contar las células por exclusión de azul tripán.
   1. Retire 20 l de suspensión celular y añadir 180 l de azul de tripano a un tubo de microcentrífuga y mezclar bien. Después de 5 min, añadir 10 l de células hemocitómetro y contar las células no azules bajo el microscopio etiquetados. Determinar el número total de células viables. Deseche celular / azul tripán mezcla.
10. Centrifugar las células en 10 ml de Etiquetado Buffer a 450 xg durante 7 minutos. Desechar el sobrenadante vertiendo o por succión al vacío en un contenedor de residuos.

3. Enriquecimiento de las células T CD4 ⁺

NOTA: Siga las instrucciones del fabricante para los productos específicos que se utilizan en esta sección.

1. Resuspender suavemente las células a una suspensión de una sola célula de 20 x 10 ⁶ células / ml en frío Labeling Buffer.
2. Añadir 5 l por 1 x 10 ⁶ células T CD4 anticuerpos enriquecimiento celular con biotina. Se incuban las células en hielo durante 15 min.
3. Añadir 10x volumen de Etiquetado Buffer. Centrifugar las células a 450 xg durante 7 minutos. Aspirar con cuidado todo el sobrenadante mediante aspiración al vacío en un contenedor de residuos.
4. Completamente vórtice partículas magnéticas conjugadas con estreptavidina. Añadir 5 l de partículas por 1 x 10 ⁶ células.
5. Mezclar bien pero con suavidad. Mantener la mezcla a 6-12 ° C durante 30 min.
6. Añadir Labeling Buffer a una concentración de 20-80 x 10 ⁶ células / ml. Transferencia de hasta 1,0 ml células marcadas por tubo de ensayo de fondo redondo de 12 x 75 mm (en adelante, el "tubo-fracción positiva").
7. Colocar cada tubo de fracción positiva en el imán durante 6-8 min.
8. Con los tubos de fracción positiva fijas en el imán, transferir cuidadosamente el sobrenadante de tubo de fracción positiva con pipeta Pasteur de vidrio a un nuevo tubo cónico de 50 ml estériles (referred como la "fracción enriquecida"). Esta fracción enriquecida contiene células T CD4 ^+. Tenga cuidado de no romper las células marcadas atraídos por el imán.
9. Resuspender las células dejan en los tubos de la fracción positiva en el mismo volumen de Etiquetado Buffer como en el paso 3.6 pipeta hacia arriba y hacia abajo con fuerza. Coloque el tubo-fracción positiva de vuelta en el imán de 6-8 min.
10. Con tubos de fracción positiva fijas en el imán, transferir cuidadosamente el sobrenadante (fracción enriquecida, CD4 ⁺⁾ de tubo de fracción positiva con vidrio pipeta Pasteur estéril de 50 ml tubo cónico de paso 3.8 sin afectar las células unidas al imán.
11. Repetir los pasos 3.9 a 3.10 para aumentar el rendimiento de las células T CD4 ⁺ obtenidos. Continuar utilizando protocolo fracción enriquecida (células CD4 ^+).

4. Etiquetado y ordenar celdas ⁷

1. Centrifugar las células enriquecido a 450 xg durante 7 min. Desechar el sobrenadante vertiendo o SUCT vacíoiones en un contenedor de residuos.
2. Resuspender las células en 1 ml de Etiquetado Buffer. Eliminar alícuota de células para contar y para evaluar la viabilidad celular por exclusión con azul de tripano como en el paso 2.9.
3. Añadir un volumen de Etiquetado Buffer de 10 x 10 ⁶ células / ml; si las células ya están <10 x 10 ^6, centrifugar a 450 xg durante 7 min, desechar el sobrenadante vertiendo o succión de vacío en el contenedor de residuos, y aumentar el volumen del etiquetado Buffer de 10 x 10 ⁶ células / ml.
   1. Establecer alícuotas separadas de aproximadamente 5 a 10 × 10 ⁵ células cada una de las células de control sin teñir, isotipo manchados, y de un solo manchado en tubos de microcentrífuga.
4. Añadir 5 g / ml-CD4 FITC y 1 mg / ml CD45RB-PE a las células. Añadir manchas de control de isotipo y las manchas individuales a la misma concentración a partes alícuotas en tubos de microcentrífuga apropiarse. Mezclar bien pero suavemente y se incuba en hielo protegidas de la luz durante 30 min.
5. Añadir 10x volumen de Etiquetado Buffer a las células y el controls. Centrífuga 450 xg durante 7 minutos. Desechar el sobrenadante por succión al vacío en un contenedor de residuos.
6. Resuspender en Labeling Buffer de volumen en el paso 4.5. Centrífuga 450 xg durante 7 minutos. Desechar el sobrenadante por succión al vacío en un contenedor de residuos.
7. Resuspender en Labeling Buffer de 10 x 10 ⁶ células / ml. Pase células a través de 70 micras filtro en el tubo de FACS. Mantener en hielo protegido de la luz hasta el momento de FACS.
8. Establecer y determinar la indemnización correspondiente en el clasificador de células con células sin teñir y controles individuales de colores.
9. Excluir células no viables con gating a plazo y de dispersión lateral (Figura 1). Configure gating CD4 ⁺ y células CD45RB ⁺ con controles de isotipo manchados. Células Gate sobre la población CD4 ^+.
10. Ordenar CD4 ⁺ CD45RB células en ^alto y CD45RB poblaciones de ^bajos utilizando un histograma simple para células PE-manchado en tubos con 2 ml de medios completos. El CD45RB ^alta población representa el más alto 40% de CD4 ⁺ CD45RB ⁺ células (CD45RB ^alta), y la ^baja población CD45RB es el 20% más bajo de células CD4 ⁺ CD45RB ⁺ (CD45RB ^baja; Figura 1B).

Figura 1: Flujo de Representante citometría de parcelas de poblaciones de células CD4 ⁺ CD45RB T durante el análisis FACS (A - C) FITC y CD4 PE esplenocitos CD45RB manchada-de donantes C57BL / 6 ratones fueron ordenados por FACS en CD4 ⁺ CD45RB ^alta y CD4 ^+. CD45RB poblaciones de células T ^baja. Eventos (A) Doublet fueron excluidos del gráfico de dispersión hacia adelante. (B) Los linfocitos fueron cerrada en la dispersión frontal y lateral trama. (C) CD4 ⁺ células T fueron cerrada, y las células T (D) CD4 ⁺ CD45RB ⁺ se representaron en un PE frente Eventos histograma. ^Bajo las células CD4 ⁺ CD45RB se consideraron el 20% más bajo de células CD45RB ^+. Pilas de ^gran CD4 ⁺ CD45RB se definieron como la más alta 40% de las células CD45RB ^+.

11. Ejecutar una alícuota de cada población celular en la máquina de FACS para evaluar la pureza de las poblaciones.
12. Centrífuga ordenadas células a 450 xg durante 7 minutos. Resuspender en 1 ml de PBS. Eliminar alícuota de células para contar y para evaluar la viabilidad celular por exclusión con azul de tripano como en el paso 2.9.

5. La inyección de células en Destinatarios

1. Resuspender las células ordenadas a 4 x 10 ⁶ células / ml (CD45RB ^alta) o 2 x 10 ⁶ células / ml (CD45RB ^baja) en PBS.
2. Transfiera 100 l de células de ^alta CD45RB por destinatario al nuevo tubo estéril. Añadir 100 l de PBS pordestinatario a este tubo. Por lo tanto, el volumen total de inyección por animal es de 200 l, y la cantidad total de células por beneficiario es de 4 ^altos células T ingenuas x 10 ⁵ células CD4 ⁺ CD45RB.
3. Si se desea grupo experimental que recibe las células T reguladoras, transferir 100 l de células de ^alta CD45RB por destinatario al nuevo tubo estéril. Añadir 100 l de células de ^baja CD45RB por destinatario al mismo tubo. Volumen total de inyección por animal es de 200 l; relación de ^alta CD45RB: células de ^baja CD45RB es 2: 1.
4. Inyectar 100 l de CD45RB ^alta o CD45RB células ^{de alta} CD45RB ^bajos CD4 / ⁺ por vía intraperitoneal en el lado derecho e izquierdo del abdomen (un total de 200 l) de cada destinatario.

6. Seguimiento de la progresión de la enfermedad en los animales receptores

1. Para evaluar el estado clínico de los animales receptores, asignar puntuaciones clínicas agregadas para los siguientes Parameters ⁸ en el día de la inyección, después semanalmente, y en el momento del sacrificio:
   1. Determinar perder midiendo la pérdida de peso: 0 - sin pérdida de peso; Pérdida de 0,1 a 10% del peso corporal inicial - 1; 2 - la pérdida de más de 10% del peso corporal inicial (Figura 2A).

Figura 2: signos patológicos y clínicos graves de inflamación se producen después de la transferencia de tipo salvaje células ^{de alta} T CD4 ⁺ CD45RB en Rag1 ^{- / -} y ratones receptores NRDKO ¹¹ (A) los receptores NRDKO perdieron en promedio el 10% de su peso corporal inicial en un 5. semanas después de la transferencia, mientras que Rag1- / - Receptores no mostraron signos clínicos de la enfermedad en este momento. Cada punto representa la media del porcentaje de peso corporal inicial para la cohorte ± SEM. **, P <0,005. (B) algunas ratones desarrollaron inflamación intestinal grave, como se demuestra por la presencia de prolapso rectal. Esta es una imagen representativa de prolapso rectal en un ratón receptor NRDKO. (C) Grueso, dos puntos, tanto de Rag1 ^{- / -} y ratones receptores NRDKO se espesan y acortan en comparación con los dos puntos de Rag1 ^{- / -} y ratones NRDKO sin transferencia adoptiva de células T. Los dos puntos de los ratones receptores NRDKO muestran inflamación severa y aumento del peso de los dos puntos (datos no mostrados). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. 2. Determinar la calidad de las heces mediante la colocación de los animales en un recipiente limpio hasta que haya pasadotaburete: 0 - ninguno; 1 - heces blandas; 2 - heces acuosas y / o con sangre.
   3. Determinar la salud general de los animales por la presencia de los siguientes signos de enfermedad: 0 - sin postura encorvada, erizado la piel, o la piel lesiones; 1 - cualquiera de los siguientes presente: encorvado postura, cerdas de piel o lesiones en la piel.
   4. Determinar la presencia de prolapso rectal: 0 - ausente; 1 - presente (Figura 2B).
2. Sacrificar animales por inhalación de CO ₂ seguido por dislocación cervical cuando han perdido el 20% de su peso corporal inicial o en el punto de tiempo deseado, lo que ocurra primero. La enfermedad clínica suele ser evidente a partir de las 5 semanas después de la reposición.
3. Valorar la gravedad de la enfermedad a lo descrito previamente ^5,7.
   1. Asignar puntuaciones clínicas como en el paso 6.1 ^8.
   2. Medir la longitud del colon y el peso (Figura 2C).
   3. Realizar el análisis histológico de la inflamación5.
   4. Determinar la expresión de citoquinas espontánea en cultivos de explantes de tejido intestinal ^9, nódulos linfáticos mesentéricos ^10, y / o suero ^11.
      1. En pocas palabras, para cultivos de explantes ^9, quitar dos puntos después del sacrificio, abierta longitudinalmente, y limpia con PBS. Incubar dos puntos en un agitador orbital fijado en 250 rpm en medios completos de 30 min a temperatura ambiente.
      2. Picar el tejido en trozos pequeños y se incubaron a 37 ° C en medios completos para 24 hr. Recoger el sobrenadante y usar para la cuantificación de citoquinas por 100 mg de tejido por ELISA.
   5. Realizar ex vivo caracterización de fenotipos de células T y / o la función ^10.

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Resultados

Aproximadamente 10 x 10 ⁶ células ^{de alta} T CD4 ⁺ CD45RB de 10 bazos de adultos C57BL / 6 ratones donantes son confiablemente aislado. Este número variará dependiendo de la edad y la cepa del ratón donante y el dominio del investigador. Cuando 4 x 10 ⁵ C57BL / 6 celdas ^{de alta} T CD4 ⁺ CD45RB se transfieren a C57BL / 6 Rag1 ^{- / -} ratones receptores, los signos clínicos de la enfermedad surgen alrededor de la semana 5 después de la...

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Discusión

Aquí se describe un protocolo paso a paso la inducción de la inflamación del colon en ratones mediante la transferencia adoptiva de células T CD4 ⁺ CD45RB ⁺ en ratones inmunodeficientes. Se utilizó bazo C57BL / 6 donantes y Rag1 singénico ^{- / -} ratones receptores, aunque otras cepas (por ejemplo, BALB / c, 129S6 / SvEv, diabético no obeso (NOD)) modelos y genéticos de la inmunodeficiencia (por ejemplo, SCID, Rag2 ^{- / -)} también se p...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10x PBS	Gibco	14200075
12 mm x 75 mm round-bottom tube	Falcon	352052
15 ml conical	Corning	430790
26 G x 3/8 Needle	BD Biosciences	305110
50 ml conical	Corning	430828
70 μm Cell Strainer	Fisherbrand	22363548
BD IMagnet	BD Biosciences	552311
β-mercaptoethanol	Thermo Scientific	35602
CD4-FITC IgG2b	eBioscience	11-0041
CD45RB-PE IgG2a	BD Pharminogen	553101
Complete Media			RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0.0004% β-ME
FACS tube + strainer	BD Falcon	352235
Glass Microscope Slides	Fisherbrand	12550A3
Heat-inactivated FBS	Gemini	100-106
Labeling Buffer			1x PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Lysis Buffer			0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 mM EDTA
MoFlo XDP	Beckman Coulter
Mouse CD4 T lymphocyte Enrichment Set - DM	BD Biosciences	558131
Mouse IgG2a-PE	BD Pharminogen	553457
Mouse IgG2b-FITC	eBioscience	11-4732
Pasteur pipet	Fisherbrand	13-678-20D
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning Cellgro	30-002-CI
[header]
Petri Dish	Fisherbrand	875713
Pure Ethanol 200 Proof	Decon Labs	2705-HC
RPMI-1640	Gibco	11-875-093
Syringe	BD Biosciences	309597
Trypan blue	Corning Cellgro	25-900-CI
Wash Media			RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 0.0004% β-ME