Indução de Murino inflamação intestinal por transferência adotiva de Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; Células T em imunodeficientes Mice

Resumo

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4⁺CD45RB^high T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

Resumo

Existem muitos modelos diferentes de animais disponíveis para estudar a patogênese de doenças humanas inflamatórias intestinais (DII), cada um com suas próprias vantagens e desvantagens. Descrevemos aqui um modelo de colite experimental que é iniciada por transferência adoptiva de células de baço singeneicas CD4 ⁺ CD45RB ^high T em ratinhos deficientes em receptores de células T e B. A população de células T CD4 ^{+ elevada} CD45RB que consiste em grande parte de células efectoras naive é capaz de induzir a inflamação intestinal crónica, assemelhando-se intimamente os aspectos chave da DII humana. Este método pode ser manipulado para estudar os aspectos do aparecimento e progressão da doença. Além disso, ele pode ser utilizado para estudar a função de inata e adaptativa, e as populações de células imunitárias reguladoras, e o papel da exposição ambiental, ou seja, a microbiota, na inflamação intestinal. Neste artigo, ilustram a metodologia para a indução de colite com um protocolo passo-a-passo. Este includes um vídeo de demonstração de aspectos técnicos essenciais necessários para desenvolver com sucesso este modelo murino de colite experimental para fins de pesquisa.

Introdução

The inflammatory bowel diseases (IBD) Crohn’s disease and ulcerative colitis result from an incompletely defined and complex interaction between host immune responses, genetic susceptibility, environmental factors, and the enteric luminal contents¹. Recent genome-wide association studies report associations between immune cell regulatory genes and IBD susceptibility^2,3. Both innate and adaptive immune cell intrinsic genes are represented in these studies, indicating a central role for these cell populations in IBD pathogenesis.

There currently exist more than 50 animal models of human IBD. While no one model perfectly phenocopies human IBD, many are useful for studying various aspects of human disease, including disease onset and progression and the wound-healing response. In the method described here, intestinal inflammation is initiated with syngeneic splenic CD4⁺CD45RB^high T cell adoptive transfer into T and B cell deficient recipient mice⁴. The CD4⁺CD45RB^high T cell population contains mainly naïve T cells primed for activation that are capable of inducing chronic small bowel and colonic inflammation. This method allows the researcher to modify key experimental variables, including both innate and adaptive immune cell populations, to answer biologically relevant questions relating to disease pathogenesis. Additionally, this method provides precise initiation of disease onset and a well-characterized experimental time course. This permits the kinetic study of clinical features of disease progression in mice. Intestinal inflammation induced by this method shares many features with human IBD, including chronic large and small bowel transmural inflammation, pathogenesis driven by cytokines such as TNF and IL-12, and systemic symptoms such as wasting⁵. Thus, it is an ideal model system for studying the pathogenesis of human IBD.

The method here describes in detail the protocol for inducing experimental colitis by adoptive transfer of CD4⁺CD45RB^high T cells into Rag1^-/- mice. We discuss key technical steps, expected results, optimization, and trouble-shooting. We address the required elements for the successful development of this murine model of intestinal inflammation for research purposes.

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Protocolo

NOTA: Certifique-se que todos os protocolos de animais são aprovados por e em conformidade com Institutional Animal Care e do Comitê Use regulamentos (IACUC) e no Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para a Conservação e Uso de Animais de Laboratório. Camundongos doadores podem ter sexo masculino ou feminino, mas ratos destinatário devem ser do sexo masculino. Se os destinatários do sexo feminino devem ser utilizados, os camundongos doadores têm que ser fêmeas ^5. Manter colónias usando, roupa de cama não estéril normal e água não acidificado, uma vez que estes podem causar impacto na microbiota intestinal, e, portanto, o fenótipo dos ratinhos colite ^5,6.

1. Preparação Experimental

1. Use mídia e buffers geladas. Mantenha as células no gelo durante todo o experimento.
2. Realizar o experimento na capa de risco biológico estéril usando técnica estéril.

2. Isolamento de células T do baço

1. Sacrificá camundongo doador / mice em CO ₂ câmara seguido por dislocatio cervicaln. Spray de abdômen com etanol 70%.
2. Faça uma incisão horizontal no abdômen e descascar a pele para expor peritônio. Segure peritônio longe dos órgãos internos com a pinça e fazer uma incisão no peritônio abdominal esquerda para expor e extirpar o baço.
3. Inserir o baço em 10 ml de Meios completa em uma placa de Petri. Retire e elimine o excesso de tecido do baço.
4. Use duas lâminas de vidro esterilizados para esmagar e provocar uma separação baço em suspensão de uma única célula. Suspensão de células Filtrar através de um filtro de 70 mm em um tubo de 50 ml e lavar filtro com 5 ml de Meio Completo. Coloque até 5 baços em um tubo de 50 ml cônico.
5. Centrifugar células a 450 xg por 7 min. Elimine o sobrenadante por vazamento off ou por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos.
6. Suavemente ressuspender as células em 5 ml por baço de um tampão de lise, para lisar as células vermelhas do sangue durante 10 min à temperatura ambiente. Adicionar um volume igual de meio completo (5 ml por baço) para o tubo.
7. células centrifugar a 450 xg por 7 min. Elimine o sobrenadante por vazamento off ou por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos.
8. Volte a suspender suavemente as células em 10 ml de Etiquetagem Buffer.
9. Contagem de células por exclusão de azul de tripano.
   1. Retirar 20 l de suspensão de células e adicionar 180 mL de azul tripano para um tubo de microcentrífuga e misture bem. Após 5 min, adicionar 10 ul de células e contagem em hemocitómetro células não-azul sob o microscópio rotulados. Determinar o número total de células viáveis. Descarte de células / trypan azul mix.
10. Centrifugar células em 10 ml de Etiquetagem tampão a 450 xg por 7 min. Elimine o sobrenadante por vazamento off ou por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos.

3. O enriquecimento de células T CD4 ⁺

NOTA: Siga as instruções do fabricante para produtos específicos utilizados nesta seção.

1. Suavemente ressuspender as células a uma suspensão de uma única célula de 20 x 10 ⁶ células / ml em Etiqueta frioing Buffer.
2. Adicionar 5 mL por 1 x 10 ⁶ células de anticorpos de enriquecimento de células T CD4 bioestanhados. Incubar as células em gelo durante 15 min.
3. Adicionar 10x volume de Etiquetagem Buffer. Centrifugar células a 450 × g por 7 min. Aspirar cuidadosamente todo o sobrenadante usando sucção a vácuo em um recipiente de resíduos.
4. Absolutamente vortex partículas magnéticas de estreptavidina conjugada. Adiciona-se 5 ul de partículas por 1 x 10 ⁶ células.
5. Misture bem, mas com cuidado. Mantenha a mistura a 6-12 ° C durante 30 min.
6. Adicionar Etiquetagem Tampão a uma concentração de 20-80 x 10 ⁶ células / ml. Transferir-se para 1,0 ml de células marcadas por 12 x 75 mm Tubo de ensaio de fundo redondo (referido como o "tubo-fracção positiva").
7. Coloque cada tubo fração positivo no ímã para 6-8 min.
8. Com os tubos de fração positiva ainda no ímã, transferir cuidadosamente sobrenadante do tubo-fração positiva com Pasteur de vidro pipeta para uma nova estéreis tubo de 50 ml (referred como a "fracção enriquecida"). Esta fração enriquecida contém células T CD4 ^+. Tenha cuidado para não perturbar as células marcadas atraídos pelo ímã.
9. Suspenda as células deixaram nos tubos-fração positiva no mesmo volume de Etiquetagem tampão como no passo 3,6 por pipetagem cima e para baixo vigorosamente. Coloque tube-fração positiva para trás em ímã para 6-8 min.
10. Com tubos de fração positiva ainda no ímã, transferir cuidadosamente sobrenadante (fração enriquecida, CD4 ⁺⁾ a partir de tubo-fração positiva com vidro Pasteur pipeta para estéril tubo de 50 ml a partir do passo 3.8, sem perturbar as células unidas a ímã.
11. Repita os passos 3,9-3,10 para aumentar o rendimento de células CD4 ⁺ T obtidas. Continuar protocolo utilizando fracção enriquecida (células CD4 ^+).

4. Rotulagem e Classificando Cells ⁷

1. Centrífuga enriquecido células a 450 xg por 7 min. Elimine o sobrenadante por vazamento off ou suct vácuoíon no recipiente de resíduos.
2. Ressuspender as células em 1 ml de Etiquetagem buffer. Remover alíquota de células para contar, para avaliar a viabilidade celular por exclusão com azul de tripano como no passo 2.9.
3. Adicionar um volume de Etiquetagem Buffer para 10 x 10 ⁶ células / ml; se as células já estão <10 x 10 ^6, centrifugar a 450 g durante 7 min, elimine o sobrenadante por vazamento off ou de sucção a vácuo em um recipiente de resíduos, e adicionar volume de Etiquetagem Buffer para 10 x 10 ⁶ células / ml.
   1. Configure alíquotas separadas de aproximadamente 5-10 × 10 ⁵ células cada para células de controlo não coradas, manchada de isótipo, e single-coradas em tubos de microcentrífuga.
4. Adicionam-se 5 ug / ml de CD4-FITC e 1 ug / ml a CD45RB-PE para as células. Adicionar manchas de controlo de isotipo e as manchas individuais com a mesma concentração de alíquotas em tubos de microcentrífuga apropriados. Misture bem, mas com cuidado e incubar em gelo protegida da luz durante 30 min.
5. Adicionar 10x volume de Etiquetagem Buffer para células e controles. Centrífuga 450 g durante 7 min. Elimine o sobrenadante por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos.
6. Ressuspender em Labeling Buffer para o volume na etapa 4.5. Centrífuga 450 g durante 7 min. Elimine o sobrenadante por sucção a vácuo em um recipiente de resíduos.
7. Ressuspender em Labeling Buffer para 10 x 10 ⁶ células / ml. Passa através de células 70 um filtro em tubo FACS. Mantenha no gelo protegido da luz até que esteja pronto para FACS.
8. Configure e determinar a compensação apropriada no separador de células com células não coradas e controles individuais manchada.
9. Excluir células não viáveis ​​com forwarder e side-dispersão gating (Figura 1A). Configure gating para células CD45RB ⁺ CD4 ⁺ e com controles manchada de isótipo. Células portão à população CD4 ^+.
10. Ordenar CD4 ⁺ células em CD45RB ^alta e CD45RB populações de ^baixa usando um histograma simples para as células marcadas com PE em tubos com 2 ml de Meio Completo. O CD45RB ^alta população representa o mais alto de 40% das células T CD4 ⁺ CD45RB ⁺ células (CD45RB ^alta), e a população ^{de baixa} CD45RB é o mais baixo de 20% das células CD4 ⁺ CD45RB ⁺ (CD45RB ^baixo; Figura 1B).

Figura 1: citometria de fluxo representativas parcelas de populações de células T CD4 ⁺ CD45RB durante a análise FACS (A - C) com FITC e CD4-PE esplenócitos CD45RB-corados de dadores murganhos C57BL / 6 foram classificadas por FACS em células CD4 ⁺ CD45RB ^high e CD4 ^+. populações de células T CD45RB ^baixo. Eventos (A) Doublet foram excluídos do gráfico de dispersão para a frente. (B) Os linfócitos foram fechado na trama dispersão frontal e lateral. (C) CD4 ⁺ células T foram fechado, e células (D) CD4 ⁺ CD45RB ⁺ T foram plotados em um PE contra Eventos histograma. As células T CD4 ⁺ CD45RB ^baixas foram consideradas ser a mais baixa de 20% de células ⁺ CD45RB. As células T CD4 ⁺ CD45RB ^elevados foram definidos como a mais alta de 40% de células ⁺ CD45RB.

11. Executar uma alíquota de cada população de células sobre a máquina de FACS para avaliar a pureza das populações.
12. Centrífuga classificadas células a 450 xg por 7 min. Ressuspender em 1 ml de PBS. Remover alíquota de células para contar, para avaliar a viabilidade celular por exclusão com azul de tripano como no passo 2.9.

5. injeção de células em Destinatários

1. Ressuspender classificados células a 4 x 10 ⁶ células / ml ^(alta CD45RB) ou 2 x 10 ⁶ células / ml (CD45RB ^baixo) em PBS.
2. Transferir 100 ml de células de ^alta CD45RB por beneficiário para novo tubo estéril. Adicionar 100 ul de PBS pordestinatário a este tubo. Assim, o volume total de injecção por animal é de 200 l, e valor total de células por beneficiário é de 4 x 10 ⁵ CD4 ⁺ CD45RB células T naive ^elevados.
3. Se o grupo experimental receber células T reguladoras é desejada, transferir 100 ml de células de ^alta CD45RB por beneficiário para novo tubo estéril. Adicionar 100 ul de células de ^baixa CD45RB por recipiente para o mesmo tubo. O volume total de injecção por animal é de 200 uL; proporção de CD45RB ^alta: células de ^baixa CD45RB é 2: 1.
4. Injectar 100 ul de CD45RB ^alta ou CD45RB ^alta CD45RB ^baixo CD4 ⁺ células / intraperitoneal em o lado direito e esquerdo do abdômen (total de 200 ul) de cada destinatário.

6. Monitoramento da progressão da doença em animais receptores

1. Para avaliar o estado clínico dos animais receptores, atribuir escores clínicos agregados para o seguinte parameters ⁸ no dia da injecção, decorrida uma semana, e no momento do sacrifício:
   1. Determine desperdiçando medindo a perda de peso: 0 - sem perda de peso; Perda de 0,1-10% do peso corporal inicial - 1; 2 - A perda de mais de 10% do peso corporal inicial (Figura 2A).

Figura 2: sinais patológicos clínicos e brutas de inflamação ocorrem após a transferência de tipo selvagem CD4 ⁺ CD45RB células T em ^alta RAG1 ^{- / -} e ratos destinatário NRDKO ^{11 (a)} destinatários NRDKO perderam, em média, 10% do seu peso corporal inicial por 5. semanas após a transferência, enquanto RAG1- / - Os beneficiários não apresentaram sinais clínicos da doença neste momento. Cada ponto representa a média percentual do peso corporal inicial para a coorte ± SEM. **, P <0,005. (B) Alguns ratos desenvolveram inflamação intestinal grave, como demonstrado pela presença de prolapso retal. Esta é uma imagem representativa de prolapso retal em um mouse destinatário NRDKO. (C) Grosseiramente, a partir de dois pontos, tanto RAG1 ^{- / -} e ratinhos receptores NRDKO são espessadas e menor do que os dois pontos de RAG1 ^{- / -} e ratinhos NRDKO sem transferência adoptiva de células T. Colons de ratos receptores NRDKO mostrar inflamação grave e aumentou o peso dos dois pontos (dados não mostrados). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

1. 2. Determinar a qualidade das fezes dos animais, colocando em recipiente limpo até que ele passoubanquinho: 0 - none; 1 - fezes moles; 2 - fezes aquosas e / ou com sangue.
   3. Determinar a saúde geral do animal através presença dos seguintes sinais da doença: 0 - nenhuma postura arqueada, eriçou pele, ou pele lesões; 1 - qualquer um de presente o seguinte: debruçado postura, eriçou pele, ou lesões de pele.
   4. Determinar a presença de prolapso retal: 0 - ausente; 1 - presente (Figura 2B).
2. Sacrificar animais por inalação de _CO2 seguido por deslocamento cervical, quando eles perderam 20% do seu peso corporal inicial ou no ponto de tempo desejado, o que ocorrer primeiro. A doença clínica é tipicamente evidente a partir de 5 semanas de pós-repletion.
3. Avaliar para a gravidade da doença, como descrito anteriormente ^5,7.
   1. Atribuir escores clínicos como no passo 6.1 ^8.
   2. Medir o comprimento do cólon e do peso (Figura 2C).
   3. Realizar análise histológica de inflamação5.
   4. Determine a expressão das citocinas espontânea em intestinais culturas de explantes tecido ^9, linfa mesentéricos ^10, e / ou soro ^11.
      1. Resumidamente, para culturas de explantes ^9, remover dois pontos após o sacrifício, aberta longitudinalmente, e limpo, com PBS. Incubar dois pontos, num agitador orbital a 250 rpm, em Meio Completo, durante 30 min à temperatura ambiente.
      2. Picar o tecido em pequenos pedaços e incubados a 37 ° C em Meio Completo, durante 24 h. Recolhe-se o sobrenadante e utilizar para a quantificação de citocinas por 100 mg de tecido por ELISA.
   5. Realizar ex vivo caracterização de fenótipos de células T e / ou função ^10.

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Resultados

Aproximadamente 10 x 10 ^{6 de} células T CD4 ⁺ CD45RB ^high T de baços de 10 adultos C57BL / 6 murganhos dadores são seguramente isolado. Este número variará, dependendo da idade e estirpe do rato dador e a proficiência do investigador. Quando 4 x 10 ⁵ C57BL / 6 células CD4 ⁺ T CD45RB ^alta são transferidos para C57BL / 6 RAG1 ^{- / -} ratinhos receptores, sinais clínicos da doença surgir em torno semana 5 pós-repletion ou antes, s...

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Discussão

Aqui nós descrevemos um protocolo passo-a-passo induzindo a inflamação do cólon em camundongos por transferência adotiva de células CD4 ⁺ T ⁺ CD45RB em ratos imunodeficientes. Usamos baços C57BL / 6 doadores e RAG1 singeneico ^{- / -} ratinhos receptores, embora outras estirpes (por exemplo, BALB / c, 129S6 / SvEv, não-obesos diabéticos (NOD)) modelos e genéticos da imunodeficiência (por exemplo, SCID, RAG2 ^{- / -)} também pode ser ut...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
10x PBS	Gibco	14200075
12 mm x 75 mm round-bottom tube	Falcon	352052
15 ml conical	Corning	430790
26 G x 3/8 Needle	BD Biosciences	305110
50 ml conical	Corning	430828
70 μm Cell Strainer	Fisherbrand	22363548
BD IMagnet	BD Biosciences	552311
β-mercaptoethanol	Thermo Scientific	35602
CD4-FITC IgG2b	eBioscience	11-0041
CD45RB-PE IgG2a	BD Pharminogen	553101
Complete Media			RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 10% FBS, 0.0004% β-ME
FACS tube + strainer	BD Falcon	352235
Glass Microscope Slides	Fisherbrand	12550A3
Heat-inactivated FBS	Gemini	100-106
Labeling Buffer			1x PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA
Lysis Buffer			0.08% NH4Cl, 0.1% KHCO3, 1 mM EDTA
MoFlo XDP	Beckman Coulter
Mouse CD4 T lymphocyte Enrichment Set - DM	BD Biosciences	558131
Mouse IgG2a-PE	BD Pharminogen	553457
Mouse IgG2b-FITC	eBioscience	11-4732
Pasteur pipet	Fisherbrand	13-678-20D
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning Cellgro	30-002-CI
[header]
Petri Dish	Fisherbrand	875713
Pure Ethanol 200 Proof	Decon Labs	2705-HC
RPMI-1640	Gibco	11-875-093
Syringe	BD Biosciences	309597
Trypan blue	Corning Cellgro	25-900-CI
Wash Media			RPMI-1640, 1% Pen/Strep, 0.0004% β-ME