Dynamic Contrast mejorada de imagen de resonancia magnética de un modelo ortotópico de cáncer pancreático del ratón

Resumen

The goal of this protocol is to apply dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) for orthotopic pancreatic tumor xenografts in mice. DCE-MRI is a non-invasive method to analyze microvasculature in a target tissue, and useful to assess vascular response in a tumor following a novel therapy.

Resumen

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe respiratory motion artifact in the abdominal area. Orthotopic tumor models offer advantages over subcutaneous ones, because those can reflect the primary tumor microenvironment affecting blood supply, neovascularization, and tumor cell invasion. We have recently established a protocol of DCE-MRI of orthotopic pancreatic tumor xenografts in mouse models by securing tumors with an orthogonally bent plastic board to prevent motion transfer from the chest region during imaging. The pressure by this board was localized on the abdominal area, and has not resulted in respiratory difficulty of the animals. This article demonstrates the detailed procedure of orthotopic pancreatic tumor modeling using small animals and DCE-MRI of the tumor xenografts. Quantification method of pharmacokinetic parameters in DCE-MRI is also introduced. The procedure described in this article will assist investigators to apply DCE-MRI for orthotopic gastrointestinal cancer mouse models.

Introducción

El objetivo general de este método consiste en aplicar un mayor contraste de imagen dinámica de resonancia magnética (RM-RT) para xenoinjertos de tumores pancreáticos ortotópico en ratones. DCE-MRI es un método no invasivo para evaluar la microvasculatura en un tejido diana mediante la supervisión del cambio de contraste MR durante un cierto período de tiempo después de la inyección. DCE-MRI se ha utilizado para diagnosticar los tumores malignos y para evaluar la respuesta del tumor a diversas terapias ^1-4. Cuantitativa DCE-MRI ha presentado una alta reproducibilidad ^5. Para cuantificar los parámetros farmacocinéticos de un agente de contraste MR en un tejido diana, todas las imágenes DCE-MR adquiridos en diferentes puntos temporales y mapa T1 obtenidas antes de la inyección de contraste deben ser corregistrados ^6. Sin embargo, debido a los movimientos respiratorios y peristálticas en la zona abdominal, cuantitativa DCE-MRI ha tenido una aplicación limitada para los tumores gastrointestinales.

Se han utilizado modelos de tumores de páncreas ortotópico para evaluarrespuesta de páncreas-tumor siguientes terapias biológicas y las quimioterapias ^7,8. Modelos de tumores ortotópicos se consideran superiores a los modelos subcutáneos convencionales, puesto que el microambiente en el sitio del tumor original se refleja y de ese modo la respuesta del tumor a la terapia humana se puede predecir con más precisión. Sin embargo, el páncreas del ratón se encuentra en el cuadrante superior izquierdo del abdomen, por lo cuantitativo DCE-MRI de ortotópico xenoinjertos de tumores pancreáticos en ratones no se ha aplicado fácilmente.

Hemos establecido un protocolo de DCE-MRI de los tumores abdominales en ratones mediante la fijación de los tumores usando un tablero plástico ortogonalmente doblada para evitar la transferencia de movimiento de la región del pecho ^9. La presión aplicada por este tablero fue localizado en el área abdominal, y no ha dado lugar a dificultad respiratoria. Una técnica automatizada imagen coregistration ha sido validado para DCE-MRI de los órganos abdominales en un modo sin respiración, pero realiza effectively sólo cuando las regiones objetivo se mueve lenta y regularmente ^10. La frecuencia respiratoria de los animales es variable durante la exploración, la restricción de manera física en la zona abdominal será necesario recuperar los parámetros farmacocinéticos fiables en modelos de ratón de tumores pancreáticos ortotópico. Hemos cuantificado con éxito los parámetros farmacocinéticos de un agente de contraste MR en ortotópico xenoinjertos tumorales pancreáticas utilizando el tablero plástico ortogonalmente doblada en DCE-MRI ^11-13. Aquí presentamos el procedimiento detallado de modelado tumor pancreático ortotópico, DCE-MRI de los xenoinjertos de tumores en ratones, y la cuantificación de los parámetros farmacocinéticos.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Alabama en Birmingham.

Modelado 1. ortotópico tumor pancreático Ratón

1. Cultura líneas estándar de células de páncreas-cáncer humano en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10%. Mantener todas las culturas a 37 ° C en atmósfera húmeda con 5% de CO _2.
2. Utilice 8-10 ratones graves femeninos semanas de edad combinados inmunodeficientes. Coloque jaulas de los animales a las 12 hr luz y oscuridad ciclo de 12 horas a RT (21 ± 2 ° C) y 60% de humedad.
3. Anestesiar a todos los animales utilizando la ventilación con 2% de isoflurano mezclado con oxígeno (2 l / min) a lo largo de la cirugía. Confirme la profundidad de la anestesia por reflejo pizca dedo del pie. Coloque los animales en una almohadilla térmica (37 ° C) para mantener la temperatura corporal. Aplique un ungüento oftálmico veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Y# 160;
4. Quitar el pelo en el cuadrante superior izquierdo del abdomen de cada ratón, y dar un fármaco analgésico (carpofen, 5 mg / kg de peso corporal por vía subcutánea) en la zona. Aplique una solución de betadine a la piel expuesta. Preparar instrumentos quirúrgicos esterilizados en autoclave.
5. Hacer una incisión de 1 cm en la piel y el peritoneo usando iris tijeras rectas. Retire con cuidado el páncreas desde el abdomen con unas pinzas quirúrgicas.
6. Insertar 28 G aguja de una jeringa 0,5 ml de insulina en la cola del páncreas y luego infundir lentamente una solución de 2,5 millones de células de cáncer pancreático humano en 30 l de DMEM. Confirme que una pequeña ampolla se crea en la cabeza del páncreas por la solución.
7. Coloque suavemente el páncreas en el abdomen con unas pinzas quirúrgicas. Cierre el peritoneo y la piel en la capa 1 con 2 interrumpido 5-0 suturas de Prolene, y luego terminar la anestesia. No devuelva un animal que ha sido sometido a cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente.60; Retire las suturas en 7 ~ 10 días después de la cirugía.
8. Dale otra dosis del fármaco analgésico (carpofen, 5 mg / kg de peso corporal por vía subcutánea) a las 24 horas después de la cirugía.
9. Compruebe el tamaño del tumor mediante la palpación de la zona de la cirugía usando dos dedos. Los tumores suelen sentirse más denso y más baches de los tejidos y órganos circundantes. Normalmente se tarda ~ 1 - 2 semanas para empezar a sentirse un tumor.
10. Monitorear los animales diariamente para detectar signos de enfermedad. Cuando los animales parecen enfermos (conductas de aseo personal y de evitación falta normal), nosotros los terminamos por dislocación cervical, mientras que bajo anestesia.

2. Imagen de Resonancia Magnética

1. Aplicar MRI cuando el tamaño del tumor es cerca de 5 - 7 mm de diámetro en generalmente 2 ~ 4 semanas después de la implantación de células. Utilice un escáner de RM dedicada a imágenes de pequeños animales o un escáner de RM clínica equipada con una bobina especializada para obtener imágenes de pequeños animales.
   NOTA: Se utilizó un animal pequeño escáner de RM 9.4T con una combinación de un volumen del resonador ¹ H/ Transmisor y un receptor bobina de superficie (30 mm de diámetro) (Bruker BioSpin Corp., Billerica, MA). Una bobina de superficie proporciona una mejor relación señal-ruido (SNR) ^14.
2. Preparar una MRI agente de contraste a base de gadolinio para inyectar ~ 0,1 a 0,2 mmol / kg a cada animal en ~ 0,1 hasta 0,2 ml de PBS (tampón fosfato salino).
   NOTA: Se utilizó gadoteridol, y se inyectaron 0,2 mmol / kg en 0,15 ml de PBS durante un período de 15 seg (0,1 ml / seg).
3. Prepare un tubo de micro-polietileno (longitud: 7,62 mm, diámetro interior: 0,28 mm, diámetro exterior: 0,64 mm). Inserte una aguja 30 G (longitud de 12,7 mm) en un extremo del tubo, y una aguja de 30 G romo de la punta (9,5 mm de longitud) en el otro extremo. Conectar una jeringa de 1 ml que contiene agente de contraste MR a la aguja de punta roma, y ​​empujar lentamente la jeringa para llenar todo el tubo con el agente de contraste MR.
4. Anestesiar a los animales, utilizando ventilación con ~ 1 - 2% de isoflurano mezclado con oxígeno (2 L / min) durante la preparación y formación de imágenes. Confirme la profundidad de anesthesia por reflejo pizca dedo del pie. Aplique un ungüento oftálmico veterinario en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. Dilatar la vena de la cola usando una lámpara de calor antes de la inserción de la aguja. Coge el medio de la aguja 30 G utilizando pinza de Kelly, y la inserta en la vena de la cola. Tape tanto la cola y el tubo en un pedazo de plástico o de papel cartón (10 mm de ancho x 100 mm de longitud) para mantener la recta cola.
5. Colocar el animal en posición supina en una cama de animales equipado con circulación de agua caliente (o aire caliente) para regular la temperatura corporal durante la exploración. Ajuste la temperatura en la cama a 37 ° C. Inserte una sonda de temperatura rectal para monitorear la temperatura del cuerpo durante la exploración.
6. Aplicar un tablero plástico ortogonalmente doblada en la zona abdominal. Asegúrese de que el tumor se localiza detrás del extremo superior de la placa, y luego tire hacia abajo el tablero ligeramente (~ 2 mm) para asegurarse de que el tumor se detecta por la junta. Tape el tablero a la cama de los animales con firmeza.
7. Pegue un transduce almohadilla respiraciónr (SA Instrument, Inc., Stony Brook, Nueva York) en el área del pecho para monitorear la respiración animal durante la exploración. Coloque una bobina de superficie en la parte superior de la región del tumor, y la cinta a la cama de los animales con firmeza. Empuje la cama de los animales en el escáner de RM para colocar la región del tumor en el centro de la bobina de volumen (diámetro interior: 72 mm).
8. La igualación y puesta a punto tanto para el receptor y el transmisor, seguido de calzas.
9. Comience con una secuencia de RM anatómica para localizar el tumor. Utilice una secuencia spin-echo (T2W) turbo T2 para obtener imágenes axiales con los siguientes parámetros de adquisición. Tiempo de repetición (TR) / tiempo de eco (TE) = 3000/34 mseg, 128 x 128 de matriz, 30 x 30 mm campo de visión, número de promedios = 1, longitud de los trenes de eco = 4, y 20 contiguos 1 mm en rodajas gruesas un modo entrelazado para cubrir la región entera del tumor (tiempo total de barrido: 1,6 min).
   NOTA: Dado que los tumores pancreáticos ortotópico son más difíciles que se encuentra que las subcutáneas, locali convencionalzer imágenes tienen una resolución más baja pueden no ser útiles.
10. Adquirir imágenes ponderadas en T1 (T1W) con varios ángulos de tirón para recuperar mapa T1. Para este propósito, usar un gradiente de eco enfoque ángulo MultiFlip con los siguientes parámetros: tiempo de repetición (TR) / tiempo de eco (TE) = 115/3 mseg, 128 x 128 de matriz, un campo de 30 x 30 mm de vista, el número de promedios = 4, ~ 5 - 7 1 mm de espesor cortes contiguos en un modo entrelazado para cubrir la región del tumor, y siete ángulos flip de 10, 20, 30, 40, 50, 60, y 70 (tiempo total de exploración por ángulo flip: 1 min).
    NOTA: Sin embargo, el enfoque ángulo MultiFlip es eficaz sólo cuando el campo B1 homogeneidad es alta. Si no es así, mapas de T1 se puede obtener con enfoque múltiple TR lugar ^15.
11. Adquirir imágenes T1W antes y después de la inyección de contraste de gadolinio basada MR. Utilice los mismos parámetros de adquisición y la geometría para el mapeo T1 pero con el ángulo de rotación fija de 30. Usar codificación lineal para garantizar el estado de equilibrio cuando se obtiene el centro del espacio k, especially cuando se utilizan un corto TR y un ángulo bajo flip grado. Adquirir 5 imágenes de referencia antes de la inyección de contraste. Luego de adquirir 40 imágenes tras la inyección de contraste (tiempo total de barrido: 45 min). Utilice una bomba de jeringa para inyectar agente de contraste a una velocidad constante (0,01 ml / seg).
12. Controlar la respiración de los animales de forma continua, y ajustar la concentración de isoflurano para mantener la frecuencia respiratoria a 50-100 respiraciones por min. Controle la temperatura corporal del animal a lo largo de la imagen.
13. Después de completar DCE-MRI, quítese la aguja y otras sondas, y colocar al animal en una jaula vacía camas con toallas de papel. Masajear suavemente la zona inferior del abdomen. La jaula debe ser colocado un medio bajo una lámpara de calor para permitir que el animal se mueva dentro y fuera del gradiente de calor a medida que se recupera. No deje a un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal.

3. Procesamiento y Análisis de Imágenes

1. Regi tumorales Segmento en las imágenes T2W. En imágenes T2W, la intensidad de la señal en la región del tumor es más brillante que la de los tejidos circundantes, por lo que el límite del tumor se puede delinear manualmente.
   NOTA: técnicas de segmentación semi-automáticas tales como umbralización global o contorno activo se pueden utilizar ^16,17, pero la intensidad de fondo desigual deben corregirse especialmente cuando se utiliza una bobina de superficie.
2. Crear mapas de T1 y densidad de protones. En las imágenes adquiridas T1W con una secuencia de eco de gradiente, suponiendo que el tiempo de eco (TE) es mucho menor que T2 * valor, el valor de píxel se determina por
   
   donde S ₀ es la densidad de protones, T es T _{1 1} constante de tiempo de relajación, TR es tiempo de repetición, y θ es un ángulo flip. La ecuación (1) puede ser reescrita para
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   cuando S (θ) / sinθ se sustituye con Y, y S (θ) / tanθ se sustituye por X. La ecuación (2) es una ecuación lineal, y su pendiente y la intersección se puede utilizar para recuperar T1 y S ₀ valores, respectivamente.
3. Calcular la concentración de contraste MR en imágenes DCE-MR. Cuando se inyecta medio de contraste MR basado gadolinio, T Tiempo ₁ relajación constante se cambia con el tiempo. Así, la ecuación (1) puede ser reescrita para
   
   T ₁ (t) está relacionada con la concentración de contraste MR, C (t), como sigue,
   
   donde r ₁ es la capacidad de relajación longitudinal del agente de contraste MR. Así, mediante la combinación de las ecuaciones (3) y (4), la concentración de contraste MR se determina por
   
4. Cuantificar los parámetros farmacocinéticos de MR agente de contraste. C _p (t) presenta la concentración de contraste MR en el plasma sanguíneo en el tiempo t después de iniciar la inyección de contraste. C _p (t) se denomina función de entrada arterial (AIF). Si AIF está disponible, los parámetros farmacocinéticos de agente de contraste MR pueden calcularse
   
   donde C _t (t) es la concentración de contraste MR en un tejido diana, _p v es el volumen de plasma de sangre fraccionada, v es el volumen extracelular _e extravascular fraccionada, y K ^trans es la transferencia de volumen constante. Constante de velocidad de flujo, k _ep, es igual a K ^trans dividido por v _e. Si AIF no está disponible, entonces el modelo de región de referencia puede utilizarse en lugar ^18,19. El modelo de región de referencia se basa en el modelo de Kety limitado de flujo ²⁰ y utiliza la concentración de contraste en una región de referencia para eliminar la necesidad de AIF de la siguiente manera,
   
   donde C _{t, ROI} (t), K ^{trans, ROI,} y v _{e, ROI} son la concentración de contraste, la transferencia de volumen constante, y el volumen extravascular extracelular-fraccionada, respectivamente, en la región de interés (ROI), mientras que C _{t, RR} (t), K ^{trans, RR,} y v _{e, RR} son aquellos en la región de referencia. Muscular paravertebral se selecciona a menudo como la región de referencia, y v _{e, RR} en pa murinomuscular ravertebral se supone que es constante a 0,08 ^21. Se utilizó el modelo de región de referencia.

Resultados

Células tumorales pancreáticas humanas crecen con éxito en páncreas de ratón creando un tumor sólido. La figura 1 muestra fotografías de (A) un páncreas normal donde se inyecta solución de células de tumor, y (B) un ratón representativo que lleva un xenoinjerto de tumor de páncreas ortotópico (MIA PaCa-2 ). Tumor está localizado en el cuadrante superior izquierdo del abdomen, al lado del bazo. Por lo general toma 2-4 semanas para que los tumores crezcan hasta 5-7 mm de diámetro después d...

Discusión

Hemos introducido los métodos detallados de modelado tumor pancreático ortotópico utilizando ratones inmunodeficientes, DCE-MRI de los tumores abdominales en ratones, y la cuantificación de sus parámetros cinéticos. En el modelado tumor pancreático ortotópico, se debe tener cuidado cuando se inserta una aguja en la cola del páncreas. Si tiene éxito, las células se transfieren a la cabeza de páncreas creando una pequeña ampolla. Cuando se aplica una tabla de plástico ortogonalmente doblada, es fundamental p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
DMEM	Invitrogen	11965-118
Fetal bovine serum	Harlan Laboratories	BT-9501
Betadine	Purdue products	67618-153-01
5-0 Prolene sutures	Ethicon	8720H
9.4T MR scanner	Bruker Biospin Corporation	BioSpec 94/20 USR
Gadoteridol	Bracco Diagnostics Inc	NDC 0270-1111-03
Micro-polyethelene tube	Strategic Applications, Inc	#PE-10-25
30G blunt tip needle	Strategic Applications, Inc	89134-194
Monitoring and gating system	SA instruments, Inc	Model 1030	This is an MR compatiable system to measure resiratory rating and body temperature of small animals at the same time.
Syringe pump	New Era Pump Systems, Inc.	NE-1600