Aislamiento y cultivo primario de células endoteliales aórticas de ratón

Resumen

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Resumen

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Introducción

El endotelio vascular es no sólo una capa de barrera que separa la sangre y el tejido, se considera una amplia glándula endocrina que se extiende sobre todo el árbol vascular con una superficie de 400 metros cuadrados ^1. El bienestar del endotelio es esencial para la homeostasis vascular. El endotelio disfuncional participa en diversos trastornos cardiovasculares, incluyendo la aterosclerosis, vasculitis y las lesiones por isquemia / reperfusión, etc. ^2-4. Hasta la fecha, los mecanismos celulares y moleculares específicos implicados en estos ajustes de la enfermedad no se comprenden bien debido a la naturaleza anatómica difusa de endotelio.

El ratón es un modelo importante para la investigación porque las técnicas de manipulación genética están más desarrollados en ratones que en cualquier otra especie de mamífero. Sin embargo, el aislamiento de células endoteliales aórticas primaria murino se considera particularmente difícil debido a que el pequeño tamaño de la aorta hace enzymatdigestión ic de endotelio poco práctico. Algunos informaron procedimientos para aislar y purificar las CE exijan ^5-7.

El objetivo de este protocolo es el uso de un método simple para aislar y expandir las células endoteliales de la aorta de ratón sin utilizar ningún equipo especial. En este protocolo, la aorta recién aisladas se corta en pequeños segmentos y se sembró sobre una matriz con el endotelio hacia abajo para permitir la germinación endotelial. Después de segmentos se eliminan, las células endoteliales se expandieron en medio del endotelio favorecida y están listas para experimentos después de dos o tres pasajes. Las ventajas del método descrito son que: 1) considerablemente alto número de células endoteliales se obtienen de una sola aorta; 2) la viabilidad celular está bien conservada; y 3) no se necesita ningún equipo o técnica especial. Se proporciona un medio eficaz para la identificación de los mecanismos celulares y moleculares específicos en la fisiopatología de las células endoteliales. Para aquellos que estén interesados ​​en el estudio de prLas células endoteliales cultivadas imary de cualquiera de los genes de ratones knock-out, genes knock-en ratones, o un modelo murino de la enfermedad, este protocolo es muy útil y fácil de practicar.

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Protocolo

1. Aislamiento de la aorta de los ratones

Todos los procedimientos descritos aquí fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Estatal de Wayne.

1. Poner el ratón en la cámara de inducción de la máquina de anestesia. Ajuste el flujo de isoflurano al 4% en relación con el 25% de aire fresco y 75% de O _2. Anestesiar al ratón por inhalación de isoflurano (4% para la inducción, ± 1,0% para el mantenimiento) en combinación con 25% de aire fresco y 75% de O ₂ a través de la cámara de inducción seguida de un cono de nariz dedicado. NOTA: La anestesia con isoflurano se puede entregar en 75% de aire de oxígeno / 25% o en el 100% de oxígeno.
2. Verifique el ratón cada 5 minutos hasta que el nivel adecuado de anestesia se alcanza (falta de retirada de pizca dedo del pie).
3. Tome el ratón fuera de la cámara de inducción y continuar la inhalación de isoflurano pesar de que el cono de la nariz dedicado que está conectado a la máquina de anestesia. conmutar elisoflurano fluya a 1% para mantener la anestesia.
4. Si bien es bajo anestesia, poner el ratón sobre un bloque de la cirugía, situado en su parte posterior. Use cinta de laboratorio para asegurar las extremidades.
5. Utilice una lámpara de calentamiento para mantener caliente el ratón. Mantenga la lámpara en una distancia apropiada del ratón de manera que el ratón no se sobre-calor.
6. Pulverizar el pecho con un 70% de etanol.
7. Use las tijeras de disección para abrir el abdomen de la línea media, y exponer la aorta abdominal. Abrir la cavidad torácica y exponer el corazón y los pulmones.
8. Cortar la aorta abdominal en el medio con tijeras de disección para liberar la sangre.
9. Llene una jeringa de 1 ml (con 25 aguja G) con 1 ml de PBS que contenía 1000 U / ml de heparina. Inyectar PBS que contenía 1000 U / ml de heparina para el ventrículo izquierdo y la aorta perfundir. Empuje el corazón y el pulmón con pinzas en las grandes arterias hasta el lado derecho de los ratones para exponer la aorta torácica.
10. eliminar rápidamente la aorta torácica mediante micro-difórceps ssection y ponerlo en 1x PBS helado (estéril), y luego transportar el contenedor en una campana de flujo laminar.
11. Inserte una jeringa de 1 ml equipado con 25 aguja G en un extremo de la aorta, y lavar suavemente la aorta con PBS enfriado en hielo para eliminar la sangre.
12. El uso de fórceps micro-disección para eliminar la mayor cantidad de tejido adiposo adjunto y pequeños vasos laterales como sea posible.
13. transferir inmediatamente la aorta endoteliales medio de crecimiento.
14. Cortar la aorta en 1 anillos mm utilizando una hoja de bisturí estéril. Cosecha cerca de 8 - 10 anillos por aorta.
15. Abrir cada anillo aórtico con un par de tijeras de microdisección.

2. Las semillas de los segmentos aórticos en Matrix

1. Cuando no esté en uso, mantenga la matriz reducida del factor de crecimiento de los -20 ° C para evitar la solidificación. Ponga la matriz reducida del factor de crecimiento de 4 ° C al menos durante la noche para permitir que un deshielo completa.
2. Pre-enfriar unos 6 pocillos de placas y consejos de pipeta a -20 ° C durante al menos10 minutos. Poner la placa de 6 pocillos en hielo y capa de un pocillo de la placa con 1 ml de matriz sin introducir burbujas de aire. Colocar la placa en una incubadora a 37ºC durante 20 min para permitir que la matriz se solidifique.
3. Implantar las piezas de la aorta en la matriz solidificada con unas pinzas de disección micro-estériles. Colocar las piezas lumen del lado de abajo en la matriz sin tocar el endotelio. Coloque 3 - 4 segmentos aórticos cerca uno del otro en la matriz.
4. Añadir la cantidad necesaria medio de crecimiento de células endoteliales para mantener húmeda segmentos (~ 200 l).
5. Incubar la placa a 37 ° C en 5% de _CO2 durante 4 a 6 h. Al final del día, añadir suficiente medio para cubrir los segmentos aórticos.
6. Observe el segmento aórtico brotación periódicamente bajo un microscopio de contraste de fase. Comprobar el nivel de mediano y crecimiento de las células cada día. Se añade medio si es necesario para mantener los segmentos aórticos cubiertos.
7. En el ^4º día, retire suavemente el medio y eliminar los segmentos de aorta fesde la matriz usando una aguja estéril sin interrumpir las células endoteliales en crecimiento.
8. Añadir 2 ml de nuevo medio de crecimiento de células endoteliales y permitir que las células endoteliales siguen proliferando en la matriz durante 2 - 3 días.

3. pases inicial de las células endoteliales aórticas de ratón

1. Escudo un nuevo matraz T12.5 con gelatina (0,1%), se incuba a 37 ° C durante 30 min.
2. Lavar las placas de matriz estéril cuidadosamente con 37 ° C de PBS.
3. Añadir 2 ml de proteinasa neutra (50 U / ml) a las placas de matriz y se incuba a temperatura ambiente en eje de balancín plataforma con agitación ocasional. Compruebe las células bajo un microscopio de contraste de fase para asegurarse de que la mayoría de las células se separan.
4. Añadir 2 ml de D-Val para inactivar la proteinasa neutra.
5. Recoger el sobrenadante cuidadosamente en un tubo de centrífuga de 15 mL. Lavar la placa con 2 ml de D-Val y recoger el sobrenadante.
6. Centrifugar la suspensión celular a 900 xg durante 5 min a Roola temperatura m.
7. Vuelva a suspender el sedimento de células en 4 ml de medio de crecimiento de células endoteliales y la placa en el matraz T12.5 recubierto con gelatina. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de _CO2 durante 2 h.
8. Reemplazar el medio. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO ₂ hasta que son 85% - 90% de confluencia.

4. pases de las células endoteliales aórticas de ratón

1. Coat dos nuevos matraces T12.5 con gelatina (0,1%), se incuba a 37 ° C durante 30 min. Pre-calor tripsina-EDTA (0,25% de tripsina, EDTA 0,02 en PBS) y PBS estéril a 37 ° C durante aproximadamente 15 min.
2. Lavar las células cuidadosamente con estéril PBS 37 ° C.
3. Añadir 0,5 ml de tripsina-EDTA (0,25% de tripsina, EDTA 0,02 en PBS) y se incuba a 37 ° C durante ~ 1 min o hasta que la mayoría de las células darse la vuelta.
4. Añadir 2 ml de medio de crecimiento de células endoteliales para detener la digestión. Pipetear la suspensión de células arriba y hacia abajo dentro de los tiempos matraz varios. Si es necesario, utilice una célularaspador para recoger las células.
5. Recoger la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar la suspensión celular a 900 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
6. Vuelva a suspender el sedimento de células en 4 ml de medio de crecimiento de células endoteliales y la placa en 2 frascos T12.5 recubiertas con gelatina. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de _CO2 durante 2 h.
7. Reemplazar el medio. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO ₂ hasta que son 85% - 90% de confluencia.
8. Use las células endoteliales de aorta de ratón después de 2 - 3 pasajes.

5. Caracterización de las células endoteliales de aorta de ratón

1. Re-placa de las células.
   1. Escudo una placa de 6 pocillos con gelatina (0,1%), se incuba a 37 ° C durante 30 min. Aclarar la placa con PBS.
   2. Pre-calentar la tripsina-EDTA y PBS estéril a 37 ° C durante aproximadamente 15 min.
   3. Se lavan las células con PBS estéril 3 veces. Añadir 0,5 ml de tripsina / EDTA a las células, se incuba durante ~ 1 min a 37 ° C or hasta que la mayoría de las células de darse la vuelta.
   4. Añadir 2 ml de medio de crecimiento de células endoteliales para detener la digestión. Pipetear la suspensión de células arriba y hacia abajo dentro de los tiempos matraz varios. Si es necesario, utilizar un rascador de células para recoger las células.
   5. Recoger la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar la suspensión celular a 900 xg durante 5 min a temperatura ambiente.
   6. Descartar el sobrenadante, volver a suspender las células en medio de crecimiento de las células endoteliales. Sembrar las células en placas de 6 pocillos recubiertas con gelatina a la densidad de 3 x 10 ⁵ / pocillo.
   7. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C, 5% de CO ₂ para permitir que las células se unan a la superficie de cultivo.
2. Dil-ac-LDL y especialmente captado Ulex -lectin vinculante.
   1. Almacenar el 1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetramethylindo carbocyanine perclorato marcado LDL acetilada (Dil-ac-LDL) a -20 ° C. Antes de la tinción, descongelar Dil-ac-LDL en hielo. La solu Stock Dil-ac-LDLción es 1 mg / mL. Almacenar la aglutinina marcada con FITC Ulex europaeus (Ulex -Lectin, 1 mg / ml) a 4 ° C. La solución madre Ulex -Lectin es 1 mg / mL. Tienda Hoechst 33342 a 4 ° C. La solución madre Hoechst 33342 es 100 mg / ml.
   2. Añadir 10 l de Dil-ac-LDL solución madre a 1 ml de medio de cultivo para hacer una concentración final de 10 mg / ml.
   3. Antes de la tinción, se elimina el medio viejo y se lavan las células en cada pocillo con medio nuevo.
   4. Retire el nuevo medio y se añade el medio de tinción Dil-ac-LDL.
   5. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de _CO2 durante 1 h.
   6. Se lavan las células con PBS 1x estéril 3 veces.
   7. Añadir 1 ml de formalina al 10% para fijar las células. Poner la placa en la temperatura ambiente durante aproximadamente 30 min.
   8. Se lavan las células con PBS 1x estéril 3 veces. Evitar la luz.
   9. Añadir 1 ml de PBS 1x estéril que contiene 10 l de Ulex -Lectin.
   10. Se incuban las células a temperatu de la habitaciónvolver en la oscuridad durante 1 h.
   11. Retire el Ulex-lectina por lavado de las células con PBS 1x estéril 3 veces.
   12. Añadir Hoechst 33342 a concentración final de 1 mg / ml, se incuban 10 min en la oscuridad.
   13. Ver la fluorescencia de Dil-ac-LDL (rojo, longitud de onda de excitación de 576 nm), Ulex -Lectin (verde, la excitación de longitud de onda de 519 nm) y Hoechst (azul, longitud de onda de excitación de 361 nm) con un microscopio de fluorescencia invertida.
3. La tinción fluorescente para CD31, VEGFR2, eNOS, VE-cadherina y calponin.
   1. Tienda FITC-conjugado anticuerpo anti-ratón CD31, anticuerpo eNOS, VE-cadherina anticuerpo, conjugado con FITC IgG anti-conejo a 4 ° C en la oscuridad. Tienda de anticuerpos VEGFR2 en -20 ° C.
   2. Se lavan las células con PBS 1x estéril 3 veces.
   3. Añadir 1 ml de formalina al 10% para fijar las células. Poner la placa en la temperatura ambiente durante aproximadamente 30 min.
   4. Se lavan las células con PBS 1x estéril 3 veces.
   5. Para la tinción de CD31, añadir 1 ml de 1x estérilPBS que contiene 10 l de anticuerpo CD31-FITC. Para teñir ya sea VEGFR2, eNOS, VE-cadherina o calponin, agregar 1 ml de PBS 1x estéril que contiene 4 l de VEGFR2, eNOS, VE-cadherina o calponin anticuerpo primario, respectivamente.
   6. Se incuban las células en hielo durante 1 h en la oscuridad.
   7. Eliminar los anticuerpos por lavado de las células con PBS estéril 3 veces.
   8. Para la tinción de VEGFR2, eNOS, VE-cadherina o calponin, añadir 1 ml de PBS 1x estéril que contiene 10 l de IgG anti-conejo conjugado con FITC. Se incuban las células en hielo durante 1 h en la oscuridad. Eliminar la IgG por lavado de las células con PBS estéril 3 veces.
   9. Añadir Hoechst 33342 a concentración final de 1 mg / ml, se incuban 10 min en la oscuridad.
   10. Ver la fluorescencia de CD31, VEGFR2, eNOS, VE-cadherina, calponin (verde, longitud de onda de excitación de 518 a 535 nm) y Hoechst (azul, longitud de onda de excitación de 361 nm) con un microscopio de fluorescencia invertida.

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Resultados

Brote de la célula endotelial

espontánea de las células endoteliales brotación comenzó a partir de un segmento de la aorta del ratón. El segmento de aorta de ratón se dejó crecer en una matriz reducida del factor de crecimiento a continuación en medio de crecimiento de células endoteliales durante 4 días. El surgimiento de las células endoteliales por lo general aparece en 2 - 4 días. Las microfotografías se tomaron el día 4 (Figura 1). Como s...

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Discusión

Este estudio demuestra un método simple para aislar y endotelial cultura células de una aorta de ratón sin ningún equipo especial. La tinción de inmunofluorescencia indicó que la mayoría de las células eran células endoteliales después de la segunda pasaje. Se sugiere que las células en segundo-tercio paso son apropiados para in vitro e in vivo para estudiar la biología endotelial.

Las Notas clave de la presente Protocolo

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4- or 6-week-old mice	Jackson Laboratory	#000664
Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	#10010-023
Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin	Sigma Aldrich	H3149
Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122])
Growth factor reduced matrix	BD Biosciences	356231
Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032)
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL)	Life Technologies	L3484
FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin)	Sigma	L9006
Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody	BD Biosciences	553372
Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody	Cell Signaling	9698
Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase	Abcam	ab5589
Anti-mouse vascular endothelium-cadherin	Abcam	33168
Anti-mouse calponin	Abcam	700
FITC-conjugated anti-rabbit IgG	Sigma	F6005
1 mL syringe fitted with 25-G needle	Fisher Scientific	50-900-04222
100 mm Peri dishes	Fisher Scientific	07-202-516
Six-well cell culture plates	Fisher Scientific	08-772-1B
T12.5 culture flask	Fisher Scientific	50-202-076
Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade	Fine Science Tools, Inc.
Anesthesia machine with isoflurane	Webster Veterianary Supply	07-806-3204
heating lamp
Centrifuge machine
Inverted phase-contrast microscope
inverted fluorescence microscope