Выделение и первичной культуре мышиных эндотелиальных клеток аорты

Резюме

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Аннотация

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Введение

Сосудистый эндотелий является не только барьерный слой , который отделяет кровь и ткани, считается обширную эндокринную железу , которая простирается по всей сосудистой сети с площадью поверхности 400 квадратных метров ^1. Благополучие эндотелия имеет важное значение для сосудистого гомеостаза. Дисфункциональной эндотелий участвует в различных сердечно - сосудистых заболеваний, в том числе атеросклероз, васкулит и ишемия / реперфузии травм и т.д. ^2-4. На сегодняшний день конкретные клеточные и молекулярные механизмы, участвующие в этих условиях болезни недостаточно хорошо изучены в связи с рассеянным анатомического характера эндотелий.

Мышь является важной моделью для исследования, поскольку генетические методы манипуляции более развиты, чем у мышей в любых других видов млекопитающих. Тем не менее, выделение первичных мышиных эндотелиальных клетках аорты считается особенно трудным, потому что малый размер аорты составляет enzymatIC переваривание эндотелий непрактичным. Некоторые из них сообщили процедуры для выделения и очистки КЭ требуют ^5-7.

Целью этого протокола является использование простой метод, чтобы изолировать и расширить эндотелиальные клетки из аорты мыши без использования какого-либо специального оборудования. В этом протоколе, свежеизолированные аорту разрезают на небольшие сегменты и высевали на матрицу с эндотелием, обращенной вниз, чтобы позволить эндотелиальной всходов. После того, как сегменты будут удалены, эндотелиальные клетки разлагаются в эндотелий благоприятствования среде и готовы к экспериментам после двух или трех проходов. Преимущества описанного способа является то, что: 1) значительно большое число эндотелиальных клеток собирают из одной аорты; 2) жизнеспособность клеток хорошо сохраняется; и 3) никакого специального оборудования или техника не требуется. Это обеспечивает эффективное средство идентификации специфических клеточных и молекулярных механизмов в клеточной патофизиологии эндотелиальной. Для тех, кто заинтересован в изучении прimary культивируемые эндотелиальные клетки либо из генов мышей нокаут, ген нокаут у мышей, или мышиной модели заболевания, этот протокол является очень полезным и легко практиковать.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Выделение аорте мышей

Все процедуры, описанные здесь, были утверждены Институциональный животных по уходу и использованию комитета Wayne State University по.

1. Поместите мышь в индукционную камеру анестезии машины. Установите поток изофлуран до 4% в сочетании с 25% свежего воздуха и 75% O _2. Обезболить мышь при вдыхании изофлуран (4% для индукции, ± 1,0% для технического обслуживания) в сочетании с 25% свежего воздуха и 75% O ₂ с помощью индукции камеры с последующим выделенным носовом обтекателе. Примечание: Анестезия с изофлуран может быть доставлен в 75% кислорода / 25% воздуха или в 100% кислорода.
2. Проверьте мышью каждые 5 мин, пока соответствующий уровень анестезии не достигается (отсутствие вывода до пят крайнем случае).
3. Возьмите мышь из индукции камеры и продолжают изофлуран ингаляции при том, что выделенный носовой конус, который подключен к анестезии машины. Переключитеизофлуран поток до 1% для поддержания анестезии.
4. В то время как под наркозом, поместите курсор на операцию на площадку, расположенную на его спине. С помощью лабораторной ленты для фиксации конечностей.
5. Используйте нагревательную лампу, чтобы сохранить тепло мыши. Держите лампу в подходящем расстоянии от мыши так, что мышь не будет чрезмерной жары.
6. Спрей груди с 70% -ным этанолом.
7. Используйте рассечение ножницами, чтобы открыть живот от средней линии, и подвергать брюшной аорты. Откройте грудной полости и обнажить сердце и легкие.
8. Обрежьте брюшной аорты в середине с рассечение ножницами, чтобы выпустить кровь.
9. Заполните 1 мл шприц (с 25 G иглой) с 1 мл PBS, содержащего 1000 Ед / мл гепарина. Вводят ПБС, содержащего 1000 ед / мл гепарина в левый желудочек и заливать аорту. Нажмите на сердце и легкие с щипцами на больших артерий к правой стороне мышей, чтобы обнажить грудную аорту.
10. Быстрое удаление грудного отдела аорты с помощью микро-диssection пинцетом и поместить его в ледяной 1X PBS (стерильный), а затем транспортировать контейнер в ламинарного потока воздуха капотом.
11. Вставьте шприц емкостью 1 мл, снабженный иглой 25 G в один конец аорты, и осторожно промывать аорту охлажденным льдом PBS, чтобы удалить кровь.
12. Использование микро-рассечение пинцет, чтобы удалить как можно больше приложенном жировой ткани и небольшие боковые сосуды, как это возможно.
13. Немедленно передать аорту в эндотелиальные среду для роста.
14. Вырезать аорту в кольцах 1 мм с использованием стерильного лезвие скальпеля. Урожай около 8 - 10 колец в аорте.
15. Откройте каждую аортального кольцо с помощью пары микро-рассечение ножницами.

2. Семя аортального Сегменты на матрице

1. Когда устройство не используется, держите фактор восстановленное матрицу роста в -20 ° C, чтобы предотвратить затвердевание. Поместите фактор восстановленное матрицу роста в 4 ° С, по крайней мере в течение ночи, чтобы обеспечить полную оттепели.
2. Предварительно охлаждать 6-луночного планшета, и советы пипеткой до -20 ° С в течение по крайней мере,10 минут. Помещенный 6-луночный планшет на льду и пальто одну лунку планшета с 1 мл матрицы без введения каких-либо воздушных пузырьков. Место пластины в 37 ° C инкубаторе в течение 20 мин, чтобы позволить матрицу затвердеть.
3. Имплантировать аортального частей на затвердевшей матрице с использованием стерильных микро-рассечение пинцет. Поместите части просвете стороной вниз на матрице, не касаясь эндотелий. 3 место - 4 аортальных сегментов близко друг к другу на матрице.
4. Добавьте достаточно просто среду роста эндотелиальных клеток, чтобы держать сегменты мокрой (~ 200 мкл).
5. Инкубируйте планшет при 37 ° С в атмосфере 5% CO ₂ в течение от 4 до 6 ч. В конце концов, добавить достаточно просто среду, чтобы покрыть аортальных сегментов.
6. Обратите внимание на аорте сегмент всходов периодически под фазово-контрастным микроскопом. Проверьте средний уровень и рост клеток каждый день. Добавьте среды, если это необходимо, чтобы держать сегменты аортального охвачены.
7. На 4 - ^й день, аккуратно удалите среду и удалить аортального сегменты пПЗУ матрицу с помощью стерильной иглой, не прерывая растущих эндотелиальных клеток.
8. Добавляют 2 мл новой среды для роста эндотелиальных клеток и позволяют эндотелиальные клетки продолжают пролиферировать на матрице в течение 2 - 3 дней.

3. Исходное Пассирование клеток мыши аортального эндотелиальных

1. Шерсть новый T12.5 колбу с желатином (0,1%), инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин.
2. Тщательно мойте матричные пластины со стерильным 37 ° C PBS.
3. Добавляют 2 мл нейтрального протеиназы (50 ед / мл) с матричными пластин и инкубировать при комнатной температуре на платформе-качалке с периодическим встряхиванием. Проверьте клетки под фазово-контрастным микроскопом, чтобы убедиться, что большинство клеток отрываются.
4. Добавляют 2 мл D-Val, чтобы инактивировать нейтральной протеиназы.
5. Собирают супернатант осторожно в 15 мл центрифужную пробирку. Промыть пластины с 2 мл D-Val и собирают супернатант.
6. Центрифуга клеточной суспензии при 900 мкг в течение 5 мин при РооТемпература м.
7. Повторное приостановить осадок клеток в 4 мл среды эндотелиального роста клеток и пластины в колбе T12.5, покрытой желатином. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ в течение 2 ч.
8. Замените среду. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO ₂ , пока они не 85% - 90% сплошности.

4. пассирования Клетки мыши эндотелия аорты

1. Покрыть два новых T12.5 колб с желатином (0,1%), инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Предварительно подогревают трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина, 0,02 ЭДТА в PBS) и стерильный PBS при 37 ° С в течение приблизительно 15 мин.
2. тщательно Вымойте клетки со стерильным 37 ° C PBS.
3. Добавьте 0,5 мл трипсин-ЭДТА (0,25% трипсина, 0,02 ЭДТА в PBS) и инкубируют при температуре 37 ° С в течение ~ 1 мин или пока большинство клеток оборачиваться.
4. Добавляют 2 мл среды для роста клеток эндотелия, чтобы остановить пищеварение. Пипетировать клеточной суспензии вверх и вниз в колбу несколько раз. При необходимости, используйте ячейкускребок для сбора клеток.
5. Собирают суспензию клеток в 15 мл центрифужную пробирку. Центрифуга клеточной суспензии при 900 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
6. Повторное приостановить осадок клеток в 4 мл среды эндотелиального роста клеток и пластины в 2-х T12.5 колбах, покрытых желатином. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ в течение 2 ч.
7. Замените среду. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO ₂ , пока они не 85% - 90% сплошности.
8. С помощью мыши эндотелиальных клеток аорты через 2 - 3 проходов.

5. Характеристика клеток мыши аортального эндотелиальных

1. Повторная пластина клеток.
   1. Покройте 6-луночный планшет с желатином (0,1%), инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Промыть пластины с PBS.
   2. Предварительно нагреть трипсин-ЭДТА и стерильный PBS до 37 ° С в течение приблизительно 15 мин.
   3. Вымойте клетки стерильной PBS 3 раза. Добавить 0,5 мл трипсин / ЭДТА к клеткам, инкубировать в течение ~ 1 мин при 37 ° С ог до большинства клеток оборачиваться.
   4. Добавляют 2 мл среды для роста клеток эндотелия, чтобы остановить пищеварение. Пипетировать клеточной суспензии вверх и вниз в колбу несколько раз. При необходимости использовать сотовый скребок для сбора клеток.
   5. Собирают суспензию клеток в 15 мл центрифужную пробирку. Центрифуга клеточной суспензии при 900 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   6. Удалите супернатант, вновь приостановить клеток в среде для роста клеток эндотелия. Семенной клеток в 6-луночный планшет , покрытый желатином при плотности 3 × 10 ⁵ / лунку.
   7. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° C, 5% CO ₂ , чтобы позволить клеткам прикрепиться к поверхности культурального.
2. Дил-ас-ЛПНП uptaken и Улекс -lectin связывания.
   1. Хранить 1,1'-диоктадециламин-3,3,3 ', 3'- tetramethylindo-карбоцианиновых перхлорат-меченых ацетилированный ЛНП (разб-AC-ЛПНП) при -20 ° С. Перед окрашиванием, оттаивать Dil-AC-ЛПНП на льду. Запас Дил-ас-ЛПНП Солуции составляет 1 мг / мл. Хранить FITC-меченного Улекс еигораеиз агглютинин (Улекс -Lectin, 1 мкг / мл) при 4 ° С. Исходный раствор Улекс -Lectin составляет 1 мг / мл. Магазин компании Hoechst 33342 при температуре 4 ° С. 33342 раствор акций Hoechst составляет 100 мкг / мл.
   2. Добавьте 10 мкл Гомотетия-AC-ЛПНП маточного раствора до 1 мл культуральной среды, чтобы получить конечную концентрацию 10 мкг / мл.
   3. Перед окрашиванием удалите старую среду и промыть клетки в каждую лунку с новой средой.
   4. Удалите новую среду и добавьте окрашивающий среду Дил-ас-ЛПНП.
   5. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ в течение 1 ч.
   6. Вымойте клетки стерильными 1x PBS 3 раза.
   7. Добавляют 1 мл 10% -ного формалина, чтобы зафиксировать клетки. Поместите пластину в комнатной температуре в течение приблизительно 30 мин.
   8. Вымойте клетки стерильными 1x PBS 3 раза. Избегайте света.
   9. Добавляют 1 мл стерильного 1x PBS, содержащий 10 мкл Улекс -Lectin.
   10. Инкубируйте клетки при комнатной temperatuповторно в темноте в течение 1 часа.
   11. Удалите Улекс-Лектиновая путем промывки клеток стерильной 1X PBS 3 раза.
   12. Добавить Hoechst 33342 до конечной концентрации 1 мкг / мл, инкубируют 10 мин в темноте.
   13. Просмотр флуоресценции Дил-Ac-ЛПНП (красный, длина волны возбуждения 576 нм), Улекс -Lectin (зеленый, длина волны возбуждения 519 нм) и Hoechst (синий, длина волны возбуждения 361 нм) с перевернутой флуоресцентного микроскопа.
3. Флуоресцентные окрашивание для CD31, VEGFR2, Енос, VE-кадгерина и Calponin.
   1. Магазин ФИТЦ-конъюгированное антитело против мышиных CD31 антитела, антитела Енос, VE-кадгерин антитела, FITC-конъюгированного антитела против кроличьего IgG при 4 ° С в темноте. Хранить VEGFR2 антитела в -20 ° C.
   2. Вымойте клетки стерильными 1x PBS 3 раза.
   3. Добавляют 1 мл 10% -ного формалина, чтобы зафиксировать клетки. Поместите пластину в комнатной температуре в течение приблизительно 30 мин.
   4. Вымойте клетки стерильными 1x PBS 3 раза.
   5. Окрасить CD31, добавьте 1 мл стерильного 1xPBS, который содержит 10 мкл CD31-FITC антителом. Для того, чтобы окрасить либо VEGFR2, Енос, VE-кадгерин или calponin, добавьте 1 мл стерильного 1x PBS, содержащего 4 мкл VEGFR2, Енос, VE-кадгерин или calponin первичным антителом, соответственно.
   6. Инкубируйте клетки на льду в течение 1 ч в темноте.
   7. Удалить антитела путем промывки клеток стерильной PBS, 3 раза.
   8. Для окрашивания VEGFR2, Енос, VE-кадгерин или calponin, добавьте 1 мл стерильного 1x PBS, содержащего 10 мкл FITC-конъюгированным анти-IgG кролика. Инкубируйте клетки на льду в течение 1 ч в темноте. Удалите IgG путем промывки клеток стерильной PBS, 3 раза.
   9. Добавить Hoechst 33342 до конечной концентрации 1 мкг / мл, инкубируют 10 мин в темноте.
   10. Просмотр флуоресценции CD31, VEGFR2, Енос, VE-кадгерин, calponin (зеленый, длина волны возбуждения 518-535 нм) и Hoechst (синий, длина волны возбуждения 361 нм) с перевернутой флуоресцентного микроскопа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Эндотелиальные клетки Проращивание

Спонтанное эндотелиальные клетки всходов начинается с сегмента мыши аорты. Сегмент мыши аорту позволяли расти на фактор-редуцированной матрицы роста затем в среде роста эндотелиальных клеток в течение 4-х дней. Ячейка прора...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Это исследование демонстрирует простой метод, чтобы изолировать и культуры эндотелиальных клеток из аорты мыши без какого-либо специального оборудования. Иммунофлюоресценции окрашивание показало, что большинство клеток были эндотелиальные клетки после второго прохода. Предполагае...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
4- or 6-week-old mice	Jackson Laboratory	#000664
Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	#10010-023
Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin	Sigma Aldrich	H3149
Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122])
Growth factor reduced matrix	BD Biosciences	356231
Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032)
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL)	Life Technologies	L3484
FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin)	Sigma	L9006
Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody	BD Biosciences	553372
Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody	Cell Signaling	9698
Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase	Abcam	ab5589
Anti-mouse vascular endothelium-cadherin	Abcam	33168
Anti-mouse calponin	Abcam	700
FITC-conjugated anti-rabbit IgG	Sigma	F6005
1 mL syringe fitted with 25-G needle	Fisher Scientific	50-900-04222
100 mm Peri dishes	Fisher Scientific	07-202-516
Six-well cell culture plates	Fisher Scientific	08-772-1B
T12.5 culture flask	Fisher Scientific	50-202-076
Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade	Fine Science Tools, Inc.
Anesthesia machine with isoflurane	Webster Veterianary Supply	07-806-3204
heating lamp
Centrifuge machine
Inverted phase-contrast microscope
inverted fluorescence microscope