マウス大動脈内皮細胞の単離および初代培養

要約

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

要約

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

概要

血管内皮細胞だけでなく、血液と組織を分離するバリア層であり、それを400正方形のメートル¹の表面積全体血管樹上に伸びる広大な内分泌腺と考えられています。内皮の幸福は、血管の恒常性に不可欠です。機能不全の内皮は、アテローム性動脈硬化症、血管炎および虚血/再灌流傷害など ^2-4を含む様々な心血管障害、に参加しています。現在までに、これらの疾患の設定に関与する特定の細胞および分子メカニズムはよく起因する内皮の拡散解剖学的性質のために理解されていません。

遺伝子操作技術は、より多くの任意の他の哺乳動物種に比べてマウスで開発されているので、マウスは、研究のための重要なモデルです。大動脈の小さなサイズがenzymatを作るためしかし、初代マウス大動脈内皮細胞の単離は、特に困難であると考えられています非現実的内皮のIC消化。いくつかは、電気部品を分離し、精製するための手順は^5-7を必要^と報告しました。

このプロトコルの目的は、特別な装置を使用せずに、マウスの大動脈から内皮細胞を分離し、展開する簡単な方法を使用することです。このプロトコルでは、新たに単離された大動脈は、小さなセグメントに切断され、内皮発芽を可能にするために下向きに内皮とマトリックス上に播種しました。セグメントが除去された後、内皮細胞は内皮好ま培地中で増殖し、二、三継代後の実験のために準備されています。記載された方法の利点は、その：1）単一の大動脈から収穫された内皮細胞のかなり高い数字。 2）細胞生存率がよく保存されています。 3）特別な装置や技術が必要とされません。これは、内皮細胞の病態生理学における特定の細胞および分子機構を同定する効果的な手段を提供します。広報の研究に興味がある人のためにimaryいずれかの遺伝子ノックアウトマウスから培養された内皮細胞は、遺伝子ノックインマウス、またはマウス疾患モデル、このプロトコルは、非常に有用と練習するのは簡単です。

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プロトコル

マウスからの大動脈の1の単離

ここで説明するすべての手順は、ウェイン州立大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。

1. 麻酔器の誘導チャンバ内にマウスを置きます。 25％新鮮な空気と75％のO ₂と併せて4％イソフルランの流れを設定します。イソフルランの吸入によりマウスを麻酔専用のノーズコーンに続く誘導室を経由して 25％の新鮮な空気と75％O ₂と連動して（誘導のために4％、保守のための±1.0％）。注：イソフルランで麻酔、75％酸素/ 25％空気中、または100％の酸素中で送達することができます。
2. 麻酔の適切なレベルが（つま先のピンチに撤退の欠如）に到達するまで、マウスを5分ごとに確認してください。
3. 誘導室の外にマウスを取り、麻酔装置に接続されている専用のノーズコーンもののイソフルラン吸入を続けます。スイッチイソフルランは、麻酔を維持するために1％へと流れます。
4. それは麻酔下であるが、その裏に位置し、手術パッド上にマウスを置きます。手足を確保するために実験室でのテープを使用してください。
5. マウスを暖かく保つために加熱ランプを使用してください。マウスはしません過熱ようにマウスから適切な距離にランプを保管してください。
6. 70％エタノールで胸をスプレーします。
7. 正中線から腹部を開き、腹部大動脈を露出するために解剖ハサミを使用してください。胸腔を開き、心臓や肺を公開します。
8. 血液を解放するために解剖ハサミで中央に腹部大動脈をカットします。
9. ヘパリン1,000 U / mLを含む1mlのPBS（25 G針を有する）1 mLシリンジを埋めます。左心室へのヘパリンの千U / mLを含むPBSを注入し、大動脈を灌流。胸部大動脈を露出するために、マウスの右サイドに大きな動脈でピンセットで心臓や肺を押してください。
10. 迅速マイクロジを使用して胸部大動脈を削除ssection鉗子や氷冷1×PBS（滅菌）に入れては、その後、層流フード内にコンテナを輸送します。
11. 大動脈の一端に25 G針を取り付けた1mLの注射器を挿入し、静かに血液を除去するために、氷冷PBSで大動脈をフラッシュします。
12. できるだけ添付脂肪組織の多くと小さな横方向の血管を除去するためのマイクロ解剖鉗子を使用してください。
13. すぐに成長培地を内皮細胞に大動脈を転送します。
14. 滅菌メスの刃を使用して、1ミリメートルのリングに大動脈をカット。収穫は約8 - 大動脈当たり10のリング。
15. マイクロ解剖ハサミを使用して、各大動脈輪を開きます。

2.種子マトリックス上の大動脈セグメント

1. 使用しないで、凝固を防止するために-20°Cで成長因子減少行列を維持します。完全な融解を可能にするために、少なくとも一晩4°Cで成長因子減少行列を置きます。
2. 少なくとも-20℃に6ウェルプレートおよびピペットチップを予冷10分。気泡を導入することなく、マトリックスの1ミリリットルと氷とプレートのコート1つのウェルに6ウェルプレートを置きます。マトリックスが固化することを可能にするために20分間37℃のインキュベーターでプレートを置きます。
3. 滅菌マイクロ解剖ピンセットを用いて固化したマトリックス上に大動脈片を移植します。内皮を触れることなく、マトリックス上のピースルーメン側を下にして置きます。マトリックス上に互いに近接4大動脈セグメント - 3を配置します。
4. （〜200μL）濡れたセグメントを維持するだけの十分な内皮細胞増殖培地を追加します。
5. 4〜6時間、5％CO ₂下、37℃でプレートをインキュベートします。一日の終わりには、大動脈のセグメントをカバーするだけの十分なメディアを追加します。
6. 位相差顕微鏡下で定期的に発芽大動脈セグメントを観察します。毎日中レベルと細胞の成長を確認してください。覆われた大動脈セグメントを維持するために必要に応じてメディアを追加します。
7. 4 ^日目に、培地に穏やかに除去し、大動脈セグメントFを削除成長している内皮細胞を中断することなく滅菌針を使用して行列をROM。
8. 新しい内皮細胞増殖培地2mlを加え、内皮細胞が2のためのマトリックスで増殖し続ける可能 - 3日。

マウス大動脈内皮細胞の3初期継代

1. コートゼラチン（0.1％）を有する新しいT12.5フラスコを、37℃で30分間インキュベートします。
2. 滅菌37℃PBSで慎重にマトリックスプレートを洗ってください。
3. マトリックスプレートに、中性プロテアーゼ（50 U / mL）を2 mLを加え、時々振とうしながら、プラットフォームロッカー上で室温でインキュベートします。細胞の大部分が分離されていることを確認するために位相差顕微鏡で細胞を確認してください。
4. ニュートラルプロテイナーゼを不活性化するためにD-ヴァルの2 mLを加え。
5. 15 mL遠心管に慎重に上清を収集します。 2 mLのD-ヴァルでプレートを洗浄し、上清を集めます。
6. ROOで5分間、900×gで細胞懸濁液を遠心メートル温度。
7. ゼラチンでコーティングされたT12.5フラスコ中の内皮細胞増殖培地およびプレート4mLに細胞ペレットを再懸濁します。 2時間、37℃、5％CO ₂で細胞をインキュベートします。
8. 培地を交換してください。 90％コンフルエント-それらが85％になるまで37℃、5％CO ₂で細胞をインキュベートします。

マウス大動脈内皮細胞の4継代

1. コート二つの新しいT12.5フラスコは、ゼラチン（0.1％）で、37℃で30分間インキュベートします。約15分間37℃で予熱トリプシン-EDTA（0.25％トリプシン、PBS中の0.02 EDTA）および滅菌PBS。
2. 滅菌37℃PBSで慎重に細胞を洗浄。
3. トリプシン-EDTA（0.25％トリプシン、PBS中0.02 EDTA）の0.5 mLを加えそして〜1分間、または細胞の大部分がラウンドを回すまで37℃でインキュベートします。
4. 消化を停止し、内皮細胞増殖培地2mlを加えます。フラスコ内を上下に数回の細胞懸濁液をピペットで。必要であれば、細胞を使用細胞を収集するためにスクレーパー。
5. 15mLの遠心管中の細胞懸濁液を収集します。室温で5分間、900×gで細胞懸濁液を遠心。
6. ゼラチンでコーティングされた2 T12.5フラスコ中で内皮細胞増殖培地およびプレート4mLに細胞ペレットを再懸濁します。 2時間、37℃、5％CO ₂で細胞をインキュベートします。
7. 培地を交換してください。 90％コンフルエント-それらが85％になるまで37℃、5％CO ₂で細胞をインキュベートします。
8. 3継代 - 2の後にマウス大動脈内皮細胞を使用してください。

マウス大動脈内皮細胞の5キャラクタリゼーション

1. 再プレート細胞。
   1. ゼラチン（0.1％）でコート6ウェルプレートを、37℃で30分間インキュベートします。 PBSでプレートを洗浄します。
   2. 約15分間37℃でトリプシン-EDTA、滅菌PBSを予熱。
   3. 滅菌PBSで3回細胞を洗浄。細胞にトリプシン/ EDTAの0.5 mLを加え、37°C​​ Oで〜1分間インキュベートR細胞の大部分がラウンドを回すまで。
   4. 消化を停止し、内皮細胞増殖培地2mlを加えます。フラスコ内を上下に数回の細胞懸濁液をピペットで。必要に応じて、細胞を収集するために、セルスクレーパーを使用しています。
   5. 15mLの遠心管中の細胞懸濁液を収集します。室温で5分間、900×gで細胞懸濁液を遠心。
   6. 上清を捨て、内皮細胞増殖培地中で細胞を再懸濁します。 3×10 ⁵ /ウェルの密度で、ゼラチンでコーティングした6ウェルプレートに細胞を播種します。
   7. 細胞が培養表面に付着できるようにするために、37℃、5％CO ₂で一晩細胞をインキュベートします。
2. DIL-AC-LDLが結合-lectin取り込まとULEX。
   1. -20℃で、1,1'-ジオクタデシル-3,3,3 'を格納する3'- tetramethylindo-カルボ過塩素酸標識アセチル化LDL（ディル-AC-LDL）。染色前に、氷上でのDil-AC-LDLを解凍。株式のDil-AC-LDLのソリューンを1mg / mLです。 4℃でFITC標識ハリエニシダ凝集素（ULEX -Lectin、を1μg/ ml）を保管してください。ストックULEX -Lectin溶液を1mg / mLです。 4℃で保存ヘキスト33342。ストックヘキスト33342ソリューションは、100μg/ mLのです。
   2. 10μg/ mLの最終濃度を作るために、培養培地の1 mLにディル-AC-LDLストック溶液10μLを追加します。
   3. 染色の前に、古い培地を除去し、新しい培地を各ウェルに細胞を洗浄します。
   4. 新しいメディアを取り外し、ディル-AC-LDL染色媒体を追加します。
   5. 1時間、37℃、5％CO ₂で細胞をインキュベートします。
   6. 滅菌1×PBSで3回細胞を洗浄。
   7. 細胞を固定するために10％ホルマリンの1 mLを加え。約30分間室温でプレートを置きます。
   8. 滅菌1×PBSで3回細胞を洗浄。光を避けてください。
   9. ULEX -Lectinの10μLを含んで1 mLの滅菌1×PBSを追加します。
   10. 部屋のtemperatuで細胞をインキュベート1時間、暗所で再び。
   11. 滅菌1×PBSで3回細胞を洗浄することによりULEX-レクチンを削除します。
   12. 暗闇の中で10分間インキュベート、最終濃度1μg/ mLにヘキスト33342を追加します。
   13. 倒立蛍光顕微鏡でのDil-AC-LDL（赤、576 nmでの励起波長）、ULEX -Lectin（緑、519 nmでの励起波長）とヘキスト（361ナノメートルの青、励起波長）の蛍光を表示します。
3. CD31、VEGFR2、eNOSのための蛍光染色は、VEカドヘリンとカルポニンを。
   1. 店舗FITC結合抗マウスCD31抗体、eNOSの抗体は、VEカドヘリンの4℃での抗体、FITC結合抗ウサギIgGを暗所。 -20°Cで保管してVEGFR2抗体。
   2. 滅菌1×PBSで3回細胞を洗浄。
   3. 細胞を固定するために10％ホルマリンの1 mLを加え。約30分間室温でプレートを置きます。
   4. 滅菌1×PBSで3回細胞を洗浄。
   5. CD31を染色するために、1 mLの滅菌1Xのを追加します。CD31-FITC抗体の10μLを含んでいるPBS。 VEGFR2、eNOSの、VEカドヘリンまたはカルポニンを、VEGFR2の4μLを含有する滅菌1×PBSの1 mLを加え、eNOSのいずれかを染色するには、それぞれ、またはカルポニン一次抗体カドヘリンをVE。
   6. 暗所で1時間、氷上で細胞をインキュベートします。
   7. 滅菌PBSで3回細胞を洗浄することにより抗体を除去します。
   8. VEGFR2の染色のために、eNOSのは、VEカドヘリンまたはカルポニン、FITC結合抗ウサギIgGの10μLを含む滅菌1×PBSの1 mLを加え。暗所で1時間、氷上で細胞をインキュベートします。滅菌PBSで3回細胞を洗浄することによりIgGのを削除します。
   9. 暗闇の中で10分間インキュベート、最終濃度1μg/ mLにヘキスト33342を追加します。
   10. 倒立蛍光顕微鏡を用いてCD31、VEGFR2の蛍光を見る、eNOSの、VEカドヘリンを、カルポニン（緑、518から535 nmでの励起波長）とヘキスト（青、361 nmでの励起波長）。

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結果

内皮細胞の萌芽

発芽自発的内皮細胞は、マウスの大動脈セグメントから開始しました。マウスの大動脈セグメントは4日間、内皮細胞増殖培地中で成長因子減少マトリックス上で増殖させました。 4日間 - 内皮細胞の発芽は通常2に表示されます。顕微鏡写真は、4日目（ 図1）に採取しました。写真に示すように、多数の内皮細胞は、セグメント?...

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ディスカッション

この研究は、特別な装置なしで、マウスの大動脈から内皮細胞を分離し、培養するための簡単な方法を示しています。免疫蛍光染色は、細胞の大部分が第2の通路後の内皮細胞であったことを示しました。第3通路への第2の細胞は、in vitroのに適しており、in vivo実験における内皮生物学を研究することが示唆されています。

この議定書からのキ?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
4- or 6-week-old mice	Jackson Laboratory	#000664
Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	#10010-023
Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin	Sigma Aldrich	H3149
Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122])
Growth factor reduced matrix	BD Biosciences	356231
Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032)
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL)	Life Technologies	L3484
FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin)	Sigma	L9006
Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody	BD Biosciences	553372
Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody	Cell Signaling	9698
Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase	Abcam	ab5589
Anti-mouse vascular endothelium-cadherin	Abcam	33168
Anti-mouse calponin	Abcam	700
FITC-conjugated anti-rabbit IgG	Sigma	F6005
1 mL syringe fitted with 25-G needle	Fisher Scientific	50-900-04222
100 mm Peri dishes	Fisher Scientific	07-202-516
Six-well cell culture plates	Fisher Scientific	08-772-1B
T12.5 culture flask	Fisher Scientific	50-202-076
Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade	Fine Science Tools, Inc.
Anesthesia machine with isoflurane	Webster Veterianary Supply	07-806-3204
heating lamp
Centrifuge machine
Inverted phase-contrast microscope
inverted fluorescence microscope