Isolamento e cultura primária de células de camundongo aórtica endoteliais

Resumo

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Resumo

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Introdução

O endotélio vascular é não só uma camada de barreira que separa o sangue e os tecidos, considera-se um grande glândula endócrina que se estende ao longo de toda a árvore vascular com uma área de superfície de 400 metros quadrados ^1. O bem-estar do endotélio é essencial para a homeostase vascular. O endotélio disfuncional participa em várias desordens cardiovasculares, incluindo a aterosclerose, vasculite e a lesão de isquemia / reperfusão, etc. ^2-4. Até à data, os mecanismos celulares e moleculares específicos envolvidos nestas configurações de doença não são bem compreendidos, devido à natureza anatómica difusa de endotélio.

O rato é um modelo importante para a pesquisa porque as técnicas de manipulação genética são mais desenvolvidos em ratos do que em quaisquer outras espécies de mamíferos. No entanto, o isolamento de células endoteliais de aorta de murino primário é considerado particularmente difícil devido ao pequeno tamanho da aorta torna enzymatIC digestão do endotélio impraticável. Alguns relataram procedimentos para isolar e purificar ECs exigem ^5-7.

O objetivo deste protocolo é a utilização de um método simples para isolar e expandir células endoteliais da aorta do rato sem o uso de qualquer equipamento especial. Neste protocolo, a aorta isolada de fresco é cortada em pequenos segmentos e semearam-se sobre uma matriz com o endotélio virada para baixo para permitir a germinação endotelial. Após segmentos são removidos, as células endoteliais são expandidos em forma favorecida do endotélio e está pronto para experimentos após dois ou três passagens. As vantagens do método descrito são as seguintes: 1) consideravelmente elevados números de células endoteliais são colhidas a partir de um único aorta; 2) a viabilidade das células é bem preservada; e 3) é necessário nenhum equipamento ou técnica especial. Ele fornece um meio eficaz de identificar mecanismos celulares e moleculares específicos na fisiopatologia das células endoteliais. Para aqueles que estão interessados ​​em estudar prcélulas endoteliais cultivadas imary de ambos os camundongos knock-out de genes, gene knock-in ratos, ou um modelo de doença murino, este protocolo é muito útil e fácil de praticar.

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Protocolo

1. Isolamento de aorta de ratinhos

Todos os procedimentos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal de Wayne State University.

1. Coloque o mouse na câmara de indução da máquina de anestesia. Defina o fluxo de isoflurano a 4% em conjunto com 25% de ar fresco e 75% de O _2. Anestesiar o rato por inalação de isoflurano (4% para indução, ± 1,0% para manutenção) em conjunto com 25% de ar fresco e 75% de O _2, por intermédio da câmara de indução seguida por um cone de nariz dedicado. NOTA: Anestesia com isoflurano pode ser entregue em 75% de ar, de oxigénio / 25% ou 100% em oxigénio.
2. Verifique o mouse a cada 5 minutos até que o nível adequado de anestesia é alcançado (falta de retirada pitada tep).
3. Aqui o rato para fora da câmara de indução e continuar a inalação de isoflurano que o cone do nariz dedicado que é ligado ao equipamento de anestesia. alternar aisoflurano fluir para 1% para manter a anestesia.
4. Embora seja sob anestesia, coloque o mouse sobre um bloco de cirurgia, posicionadas em suas costas. Use fita de laboratório para proteger os membros.
5. Use uma lâmpada de aquecimento para manter o rato quente. Mantenha a lâmpada em uma distância adequada do mouse para que o rato não vai mais ao calor.
6. Pulveriza-se a caixa com 70% de etanol.
7. Use tesouras de dissecação para abrir o abdómen da linha média, e expor a aorta abdominal. Abrir a cavidade torácica e expor o coração e os pulmões.
8. Corte a aorta abdominal no meio com uma tesoura de dissecção para liberar o sangue.
9. Encha uma seringa de 1 ml (com 25 g de agulhas) com 1 ml de PBS contendo 1.000 U / ml de heparina. Injectar PBS contendo 1.000 U / ml de heparina no ventrículo esquerdo e a aorta perfundir. Empurrar o coração e o pulmão com uma pinça com as grandes artérias para o lado direito dos ratinhos para expor a aorta torácica.
10. remover rapidamente da aorta torácica utilizando micro-diforceps ssection e colocá-lo em 1x PBS gelado (estéril), em seguida, transportar o recipiente em uma capa de fluxo de ar laminar.
11. Inserir uma seringa de 1 ml, equipado com 25 agulhas G em uma das extremidades da aorta, e lavar suavemente a aorta com PBS gelado para remover o sangue.
12. Use uma pinça micro-dissecção para remover o máximo do tecido adiposo em anexo e pequenos vasos laterais possível.
13. Imediatamente transferir a aorta para meio de crescimento endotelial.
14. Corte a aorta em rodelas de 1 mm usando uma lâmina de bisturi estéril. Colheita aproximadamente 8 - 10 anéis por aorta.
15. Abra cada anel aórtico usando um par de tesouras micro-dissecção.

2. As sementes dos segmentos da aorta em Matrix

1. Quando não estiver em uso, mantenha a matriz reduzida do fator de crescimento em -20 ° C para evitar a solidificação. Coloque a matriz reduzida pelo factor de crescimento em 4 ° C, pelo menos durante a noite para permitir um descongelamento completo.
2. Pré-arref ecimento de 6 poços de placa e pontas de pipeta para -20 ° C durante pelo menos10 min. Colocar a placa de 6 poços em gelo e um revestimento das cavidades da placa com 1 ml de matriz sem introduzir quaisquer bolhas de ar. Colocar a placa num incubador de 37 ° C durante 20 min para permitir que a matriz se solidificar.
3. Implantar as peças da aorta para a matriz solidificada usando uma pinça micro-dissecção estéreis. Coloque as peças lúmen de cabeça para baixo sobre a matriz, sem tocar no endotélio. Colocar 3 - 4 segmentos aórticos próximos uns dos outros na matriz.
4. Adicionar meio de crescimento de células endoteliais apenas o suficiente para manter os segmentos molhado (~ 200 mL).
5. Incubar a placa a 37 ° C sob 5% de _CO2 durante 4 a 6 h. No final do dia, adicionar meio apenas suficiente para cobrir os segmentos aórticos.
6. Observar o segmento da aorta sprouting periodicamente sob um microscópio de contraste de fase. Verifique o nível médio e crescimento celular a cada dia. Adicionar meio se necessário para manter segmentos da aorta cobertos.
7. No dia 4 ^th, remova gentilmente o meio e retire a segmentos da aorta from a matriz, utilizando uma agulha estéril sem interromper as células endoteliais que crescem.
8. Adicionar 2 ml de meio de crescimento de células endoteliais novo e permitir que as células endoteliais continuam a proliferar na matriz durante 2 - 3 dias.

3. Passaging inicial das células endoteliais da aorta do rato

1. Revestimento de um novo frasco T12.5 com gelatina (0,1%), incuba-se a 37 ° C durante 30 min.
2. Lavam-se as placas cuidadosamente com matriz estéril 37 ° C de PBS.
3. Adicionar 2 ml de proteinase neutral (50 U / mL) para as placas de matriz e incubar à temperatura ambiente no balancim plataforma com agitação ocasional. Verifique as células em um microscópio de contraste de fase para garantir que a maioria das células são separadas.
4. Adicionar 2 mL de D-Val para inactivar a proteinase neutro.
5. Recolhe-se o sobrenadante cuidadosamente num tubo de centrífuga de 15 mL. Lava-se a placa com 2 ml de D-Val e recolher o sobrenadante.
6. Centrifugar a suspensão de células a 900 xg durante 5 min a RooTemperatura m.
7. Re-suspender o sedimento de células em 4 ml de meio de crescimento de células endoteliais e placa no balão T12.5 revestidos com gelatina. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 2 h.
8. Substituir o meio. Incubar as células a 37 ° C, 5% de _CO2 até que eles são 85% - 90% confluentes.

4. Passaging das células de camundongo aórtica endoteliais

1. Revestimento dois novos frascos T12.5 com gelatina (0,1%), incuba-se a 37 ° C durante 30 min. Pré-aqueça Tripsina-EDTA (tripsina a 0,25%, 0,02 EDTA em PBS) e PBS estéril a 37 ° C durante cerca de 15 min.
2. Lavam-se as células cuidadosamente com estéril 37 ° C de PBS.
3. Adicionar 0,5 mL de Tripsina-EDTA (tripsina a 0,25%, 0,02 EDTA em PBS) e incuba-se a 37 ° C durante ~ 1 min ou até que a maioria das células se virar.
4. Adicionar 2 ml de meio de crescimento de células endoteliais para parar a digestão. Pipetar a suspensão de células para cima e para baixo dentro dos frascos de várias vezes. Se necessário, utilizar uma célularaspador para recolher as células.
5. Recolha a suspensão celular num tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a suspensão de células a 900 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
6. Re-suspender o sedimento de células em 4 ml de meio de crescimento de células endoteliais e da placa em balões de 2 T12.5 revestidas com gelatina. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 2 h.
7. Substituir o meio. Incubar as células a 37 ° C, 5% de _CO2 até que eles são 85% - 90% confluentes.
8. Use as células endoteliais da aorta de rato após 2 - 3 passagens.

5. Caracterização das células de camundongo aórtica endoteliais

1. Re-placa das células.
   1. Bata de uma placa de 6 poços com gelatina (0,1%), incuba-se a 37 ° C durante 30 min. Lavar a placa com PBS.
   2. Pré-aqueça o Tripsina-EDTA e PBS estéril a 37 ° C durante cerca de 15 min.
   3. Lavam-se as células com PBS estéril 3 vezes. Adicionar 0,5 mL de Tripsina / EDTA para as células, incubar durante ~ 1 min a 37 ° C óR até que a maioria das células se virar.
   4. Adicionar 2 ml de meio de crescimento de células endoteliais para parar a digestão. Pipetar a suspensão de células para cima e para baixo dentro dos frascos de várias vezes. Se necessário, utilizar um raspador de células para recolher as células.
   5. Recolha a suspensão celular num tubo de centrífuga de 15 mL. Centrifugar a suspensão de células a 900 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
   6. Descartar o sobrenadante, re-suspender as células em meio de crescimento de células endoteliais. Semear as células em placas de 6 poços revestidas com gelatina a uma densidade de 3 x 10 ⁵ / poço.
   7. Incubam-se as células durante a noite a 37 ° C, 5% de _CO2 para permitir que as células se fixem à superfície da cultura.
2. Dil-ac-LDL captado e Ulex -lectin vinculativo.
   1. Armazenar o 1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-tetramethylindo carbocianina marcado com perclorato de LDL acetilada (Dil-ac-LDL) a -20 ° C. Antes da coloração, descongelar Dil-ac-LDL em gelo. A solu estoque Dil-ac-LDLção é de 1 mg / mL. Armazenar a aglutinina marcado com FITC Ulex europaeus (Ulex -Lectin, 1 ug / mL) a 4 ° C. A solução Ulex -Lectin estoque é de 1 mg / mL. Loja Hoechst 33342 a 4 ° C. A 33342 solução de Hoechst é de 100 mcg / mL.
   2. Adicionar 10 ul de solução de estoque Dil-ac-LDL a 1 mL de meio de cultura para obter uma concentração final de 10 ug / mL.
   3. Antes da coloração, remover o meio velho e lavar as células em cada poço com o novo meio.
   4. Retire o novo meio e adicione o meio de coloração Dil-ac-LDL.
   5. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante 1 h.
   6. Lavam-se as células com PBS 1x estéreis 3 vezes.
   7. Adicionar 1 ml de formol a 10% para fixar as células. Colocar a placa à temperatura ambiente durante cerca de 30 min.
   8. Lavam-se as células com PBS 1x estéreis 3 vezes. Evite luz.
   9. Adicione 1 mL estéril 1x PBS que contém 10 ml de Ulex -Lectin.
   10. Incubar as células a temperatu quartore no escuro durante 1 h.
   11. Remover o Ulex-LECTINA por lavagem das células com PBS 1x estéreis 3 vezes.
   12. Adicionar a Hoechst 33342 para concentração final de 1 ug / ml, incubar 10 min no escuro.
   13. Ver a fluorescência do Dil-ac-LDL (vermelho, comprimento de onda de excitação de 576 nm), Ulex -Lectin (verde, excitação comprimento de onda de 519 nm) e Hoechst (azul, excitação comprimento de onda de 361 nm) com um microscópio de fluorescência invertido.
3. coloração fluorescente para CD31, VEGFR2, eNOS, VE-caderina e calponina.
   1. Loja anticorpo anti-ratinho CD31 conjugado com FITC, anticorpo eNOS, VE-caderina de anticorpo, anti-IgG de coelho conjugado com FITC, a 4 ° C no escuro. Loja anticorpo VEGFR2 em -20 ° C.
   2. Lavam-se as células com PBS 1x estéreis 3 vezes.
   3. Adicionar 1 ml de formol a 10% para fixar as células. Colocar a placa à temperatura ambiente durante cerca de 30 min.
   4. Lavam-se as células com PBS 1x estéreis 3 vezes.
   5. Para manchar CD31, adicione 1 mL de 1x estérilPBS que contém 10 ml de anticorpo CD31-FITC. Para manchar quer VEGFR2, eNOS, VE-caderina ou calponina, adicione 1 mL de estéril 1x PBS que contém 4 mL de VEGFR2, eNOS, VE-caderina ou calponina anticorpo primário, respectivamente.
   6. Incubar as células em gelo durante 1 h no escuro.
   7. Remover os anticorpos por lavagem das células com PBS estéril 3 vezes.
   8. Para a coloração de VEGFR2, eNOS, VE-caderina ou calponina, adicionar 1 ml de PBS estéril 1x que contém 10 ul de IgG anti-coelho conjugado com FITC. Incubar as células em gelo durante 1 h no escuro. Remover o IgG por lavagem das células com PBS estéril 3 vezes.
   9. Adicionar a Hoechst 33342 para concentração final de 1 ug / ml, incubar 10 min no escuro.
   10. Ver a fluorescência de CD31, VEGFR2, eNOS, VE-caderina, calponina (verde, comprimento de onda de excitação de 518-535 nm) e Hoechst (azul, comprimento de onda de excitação de 361 nm) com um microscópio de fluorescência invertido.

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Resultados

Sprouting celular endotelial

células endoteliais espontânea brotando iniciado a partir de um segmento do mouse aorta. O segmento de rato aorta foi deixada crescer numa matriz reduzida pelo factor de crescimento, em seguida, em meio de crescimento de células endoteliais durante 4 dias. O surgimento de células endoteliais normalmente aparece em 2 - 4 dias. As fotomicrografias foram tomadas no dia 4 (Figura 1). Como mostrado nas figuras, numerosas células ...

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Discussão

Este estudo demonstra um método simples para isolar e endotelial cultura células de uma aorta mouse sem qualquer equipamento especial. A coloração por imunofluorescência indicou que a maioria das células eram células endoteliais após a segunda passagem. Sugere-se que as células na segunda para a terceira passagem são adequados para in vitro e in vivo para estudar a biologia endotelial.

As Notas-chave do Protocolo Present

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4- or 6-week-old mice	Jackson Laboratory	#000664
Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	#10010-023
Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin	Sigma Aldrich	H3149
Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122])
Growth factor reduced matrix	BD Biosciences	356231
Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032)
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL)	Life Technologies	L3484
FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin)	Sigma	L9006
Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody	BD Biosciences	553372
Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody	Cell Signaling	9698
Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase	Abcam	ab5589
Anti-mouse vascular endothelium-cadherin	Abcam	33168
Anti-mouse calponin	Abcam	700
FITC-conjugated anti-rabbit IgG	Sigma	F6005
1 mL syringe fitted with 25-G needle	Fisher Scientific	50-900-04222
100 mm Peri dishes	Fisher Scientific	07-202-516
Six-well cell culture plates	Fisher Scientific	08-772-1B
T12.5 culture flask	Fisher Scientific	50-202-076
Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade	Fine Science Tools, Inc.
Anesthesia machine with isoflurane	Webster Veterianary Supply	07-806-3204
heating lamp
Centrifuge machine
Inverted phase-contrast microscope
inverted fluorescence microscope