Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

Riepilogo

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Abstract

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Introduzione

L'endotelio vascolare non è solo uno strato barriera che separa il sangue e tessuti, è considerato un vasto ghiandola endocrina che si estende per l'intero albero vascolare con una superficie di 400 metri quadrati ^1. Il benessere dell'endotelio è essenziale per l'omeostasi vascolare. L'endotelio disfunzionale partecipa a vari disturbi cardiovascolari, tra cui l'aterosclerosi, vasculite e le lesioni da ischemia / riperfusione, ecc ^2-4. Fino ad oggi, i meccanismi cellulari e molecolari specifici coinvolti in queste condizioni patologiche non sono ben compresi a causa della natura diffusa anatomica di endotelio.

Il mouse è un modello importante per la ricerca perché le tecniche di manipolazione genetica sono più sviluppati nei topi che in tutte le altre specie di mammiferi. Tuttavia, l'isolamento di murine cellule endoteliali aortiche primarie è considerato particolarmente difficile perché le piccole dimensioni dell'aorta rende enzymatic digestione dell'endotelio impraticabile. Alcuni hanno riferito le procedure per isolare e purificare EC richiede ^5-7.

L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare un metodo semplice per isolare ed espandere cellule endoteliali dall'aorta mouse senza utilizzare particolari attrezzature. In questo protocollo, l'aorta fresco isolato viene tagliato in piccoli segmenti e seminate su una matrice con l'endotelio rivolto verso il basso per consentire la germinazione endoteliale. Dopo segmenti vengono rimossi, le cellule endoteliali sono espanse in media endotelio-favorito e sono pronti per esperimenti dopo due o tre passaggi. I vantaggi del metodo descritto sono che: 1) considerevolmente elevato numero di cellule endoteliali sono raccolte da un singolo aorta; 2) la vitalità delle cellule è ben conservato; e 3) è necessaria alcuna attrezzatura speciale o tecnica. Esso fornisce un mezzo efficace per identificare i meccanismi cellulari e molecolari specifici di fisiopatologia delle cellule endoteliali. Per coloro che sono interessati a studiare primary cellule endoteliali coltivate da entrambi i topi knock-out del gene, gene knock-nei topi, o un modello di malattia murino, questo protocollo è molto utile e facile da praticare.

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Protocollo

1. Isolamento di Aorta di topi

Tutte le procedure qui descritte sono state approvate dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali della Wayne State University.

1. Mettere il mouse nella camera di induzione della macchina per anestesia. Impostare il flusso isoflurano al 4% in congiunzione con il 25% di aria fresca e il 75% O _2. Anestetizzare il mouse per inalazione di isoflurano (4% per l'induzione, ± 1,0% per la manutenzione) in combinazione con il 25% di aria fresca e il 75% O ₂ con camera di induzione seguita da un'ogiva dedicata. NOTA: anestesia con isoflurano può essere consegnato nel 75% di ossigeno / 25% di aria o ossigeno al 100%.
2. Controllare il mouse ogni 5 minuti fino a quando il livello appropriato di anestesia viene raggiunta (mancanza di recesso a pizzico tep).
3. Prendere il mouse fuori dalla camera di induzione e continuare isoflurano inalazione se l'ogiva dedicato che è collegato alla macchina per anestesia. Accendere ilisoflurano flusso al 1% per mantenere l'anestesia.
4. Mentre è sotto anestesia, mettere il mouse su un tampone chirurgico, posizionata sul dorso. Utilizzare nastro di laboratorio per fissare gli arti.
5. Utilizzare una lampada riscaldante per mantenere caldo il mouse. Mantenere la lampada in una distanza appropriata dal mouse in modo che il mouse non surriscaldamento.
6. Spruzzare il petto con il 70% di etanolo.
7. Usare le forbici dissezione per aprire l'addome dalla linea mediana, ed esporre l'aorta addominale. Aprire la cavità toracica ed esporre il cuore ei polmoni.
8. Tagliare l'aorta addominale a metà con le forbici dissezione per rilasciare il sangue.
9. Riempire una siringa da 1 ml (con il 25 ago G) con 1 ml di PBS contenente 1.000 U / mL di eparina. Iniettare PBS contenente 1,000 U / mL di eparina al ventricolo sinistro e l'aorta profumato. Premere il cuore e il polmone con una pinza a grandi arterie al lato destro dei topi per esporre l'aorta toracica.
10. Rimuovere rapidamente l'aorta toracica utilizzando micro-diforcipe ssection e metterlo in ghiaccio freddo 1x PBS (sterile), poi trasportare il contenitore in una cappa di flusso d'aria laminare.
11. Inserire una siringa da 1 ml munito 25 ago G in un'estremità dell'aorta, e lavare delicatamente l'aorta con PBS freddo per rimuovere il sangue.
12. Utilizzare pinze micro-dissezione per rimuovere la maggior quantità di tessuto adiposo allegato e piccoli vasi laterali possibile.
13. Trasferire immediatamente l'aorta a endoteliali terreno di coltura.
14. Tagliare l'aorta in anelli di 1 mm con una lama di bisturi sterile. Harvest circa 8 - 10 anelli per aorta.
15. Aprire ogni anello aortico utilizzando un paio di forbici micro-dissezione.

2. Seed i segmenti aortici su matrice

1. Quando non in uso, mantenere la matrice fattore-ridotto la crescita in -20 ° C per evitare la solidificazione. Mettere la matrice fattore-ridotto la crescita in 4 ° C almeno per una notte per consentire un disgelo completo.
2. Preraffreddare a 6 pozzetti punte piastra e pipette a -20 ° C per almeno10 minuti. Mettere il 6 pozzetti su ghiaccio e cappotto un pozzetto della piastra con 1 mL di matrice senza introdurre bolle d'aria. Porre la piastra in un incubatore a 37 ° per 20 minuti per consentire la matrice solidificazione.
3. Impiantare i pezzi aortica sulla matrice solidificata utilizzando sterili pinze micro-dissezione. Mettere i pezzi lume-side-down sulla matrice senza toccare l'endotelio. Posizionare 3 - 4 segmenti aortici vicini tra loro sulla matrice.
4. Aggiungere appena abbastanza terreno di crescita delle cellule endoteliali per mantenere i segmenti bagnato (~ 200 mL).
5. Incubare la piastra a 37 ° C sotto 5% di CO ₂ per 4 a 6 ore. Alla fine della giornata, aggiungere sufficiente medio per coprire i segmenti aortici.
6. Osservare il segmento aortico germinazione periodicamente al microscopio a contrasto di fase. Controllare il livello medio e la crescita cellulare ogni giorno. Aggiungere mezzo, se necessario, per mantenere i segmenti aortici coperti.
7. Al 4 ^° giorno, rimuovere delicatamente il supporto e rimuovere il segmento aortico FROM la matrice utilizzando un ago sterile senza interrompere le crescenti cellule endoteliali.
8. Aggiungere 2 ml di nuovo terreno di coltura delle cellule endoteliali e permettono alle cellule endoteliali continuano a proliferare sulla matrice per 2 - 3 giorni.

3. Passaging iniziale delle cellule di topo aortica endoteliali

1. Coat un pallone nuovo T12.5 con gelatina (0,1%), incubare a 37 ° C per 30 min.
2. Lavare le piastre di matrice accuratamente con sterile 37 ° C PBS.
3. Aggiungere 2 ml di proteinasi neutro (50 U / mL) per le piastre di matrice e incubare a temperatura sulla piattaforma oscillante con agitazione occasionale stanza. Controllare le cellule al microscopio a contrasto di fase per assicurarsi che la maggior parte delle cellule sono staccato.
4. Aggiungere 2 ml di D-Val di inattivare la proteinasi neutro.
5. Raccogliere accuratamente il surnatante in una provetta 15 centrifuga. Lavare la piastra con 2 mL D-Val e raccogliere il surnatante.
6. Centrifugare la sospensione cellulare a 900 xg per 5 min a rooTemperatura di m.
7. Risospendere il pellet cellulare in 4 ml di terreno di coltura delle cellule endoteliali e la piastra nel pallone T12.5 rivestito con gelatina. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ per 2 h.
8. Sostituire il medium. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ fino a quando sono 85% - 90% confluenti.

4. Passaging delle cellule di topo aortica endoteliali

1. Coat due nuovi flaconi T12.5 con gelatina (0,1%), incubare a 37 ° C per 30 min. Preriscaldamento Tripsina-EDTA (0,25% tripsina, 0.02 EDTA in PBS) e sterile PBS a 37 ° C per circa 15 min.
2. Lavare le cellule con cura con sterile 37 ° C PBS.
3. Aggiungere 0,5 ml di tripsina-EDTA (0,25% tripsina, 0.02 EDTA in PBS) e incubare a 37 ° C per 1 min ~ o finché la maggioranza delle cellule girarsi.
4. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura delle cellule endoteliali per fermare la digestione. Pipetta la sospensione cellulare su e giù nei pallone più volte. Se necessario, utilizzare una cellaraschietto per raccogliere le cellule.
5. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga 15. Centrifugare la sospensione cellulare a 900 xg per 5 min a temperatura ambiente.
6. Risospendere il pellet cellulare in 4 ml di terreno di coltura delle cellule endoteliali e la piastra in 2 flaconi T12.5 rivestiti con gelatina. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ per 2 h.
7. Sostituire il medium. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ fino a quando sono 85% - 90% confluenti.
8. Utilizzare il mouse cellule endoteliali aortiche dopo 2 - 3 passaggi.

5. Caratterizzazione delle cellule di topo aortica endoteliali

1. Re-plate cellule.
   1. Coat una piastra da 6 pozzetti con gelatina (0,1%), incubare a 37 ° C per 30 min. Sciacquare la piastra con PBS.
   2. Pre-riscaldare la tripsina-EDTA e sterile PBS a 37 ° C per circa 15 min.
   3. Lavare le cellule con PBS sterile per 3 volte. Aggiungere 0,5 ml di tripsina / EDTA alle cellule, incubare per ~ 1 min a 37 ° C or finché la maggior parte delle cellule girarsi.
   4. Aggiungere 2 ml di terreno di coltura delle cellule endoteliali per fermare la digestione. Pipetta la sospensione cellulare su e giù nei pallone più volte. Se necessario, utilizzare un raschietto cellulare per raccogliere le cellule.
   5. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga 15. Centrifugare la sospensione cellulare a 900 xg per 5 min a temperatura ambiente.
   6. Eliminare il surnatante, risospendere le cellule in terreno di coltura delle cellule endoteliali. Seme le cellule in 6 pozzetti rivestiti con gelatina alla densità di 3 x 10 ⁵ / pozzetto.
   7. Incubare le cellule per una notte a 37 ° C, 5% CO ₂ per permettere alle cellule di attaccarsi alla superficie cultura.
2. Dil-ac-LDL uptaken e Ulex -lectin vincolante.
   1. Conservare il 1,1'-diottadecil-3,3,3 ', 3'-tetramethylindo carbocyanine perclorato marcato LDL acetilato (Dil-ac-LDL) a -20 ° C. Prima della colorazione, scongelare Dil-ac-LDL sul ghiaccio. Il Solu magazzino Dil-ac-LDLzione è 1 mg / mL. Conservare il europaeus agglutinin coniugati con fluoresceina Ulex (Ulex -Lectin, 1 mg / ml) a 4 ° C. La soluzione madre Ulex -Lectin è di 1 mg / mL. Conservare Hoechst 33342 a 4 ° C. La soluzione madre 33342 Hoechst è di 100 mg / ml.
   2. Aggiungere 10 ml di Dil-ac-LDL soluzione stock di 1 ml di terreno di coltura per effettuare una concentrazione finale di 10 mg / mL.
   3. Prima della colorazione, rimuovere il vecchio medie e lavare le cellule in ciascun pozzetto con nuovo mezzo.
   4. Rimuovere il nuovo mezzo e aggiungere il supporto colorazione Dil-ac-LDL.
   5. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ per 1 h.
   6. Lavare le cellule con sterili 1x PBS 3 volte.
   7. Aggiungere 1 ml di formalina al 10% per riparare le cellule. Mettere la piastra in temperatura ambiente per circa 30 min.
   8. Lavare le cellule con sterili 1x PBS 3 volte. Evitare la luce.
   9. Aggiungere 1 ml sterile 1x PBS contenente 10 ml di Ulex -Lectin.
   10. Incubare le cellule a camera tempere al buio per 1 h.
   11. Rimuovere il Ulex-lectina lavando le cellule con sterili 1x PBS 3 volte.
   12. Aggiungere Hoechst 33342 alla concentrazione finale di 1 mg / ml, incubare 10 minuti al buio.
   13. Mostra la fluorescenza di Dil-ac-LDL (rosso, eccitazione lunghezza d'onda di 576 nm), Ulex -Lectin (verde, eccitazione lunghezza d'onda di 519 nm) e Hoechst (blu, eccitazione lunghezza d'onda di 361 nm) con un microscopio a fluorescenza invertito.
3. colorazione fluorescente per CD31, VEGFR2, eNOS, VE-caderina e Calponin.
   1. Conservare FITC-coniugato anticorpo anti-topo CD31, anticorpi eNOS, VE-caderina anticorpi, FITC-coniugato anti-IgG di coniglio a 4 ° C al buio. Conservare l'anticorpo VEGFR2 a -20 ° C.
   2. Lavare le cellule con sterili 1x PBS 3 volte.
   3. Aggiungere 1 ml di formalina al 10% per riparare le cellule. Mettere la piastra in temperatura ambiente per circa 30 min.
   4. Lavare le cellule con sterili 1x PBS 3 volte.
   5. Per macchiare CD31, aggiungere 1 ml di 1x steriliPBS contenente 10 ml di anticorpi CD31-FITC. Per macchiare o VEGFR2, eNOS, VE-caderina o calponin, aggiungere 1 ml di sterile 1x PBS contenente 4 ml di VEGFR2, eNOS, VE-caderina o calponin anticorpo primario, rispettivamente.
   6. Incubare le cellule in ghiaccio per 1 ora al buio.
   7. Rimuovere gli anticorpi lavando le cellule con PBS sterile 3 volte.
   8. Per la colorazione di VEGFR2, eNOS, VE-caderina o calponin, aggiungere 1 ml di sterile 1x PBS contenente 10 ml di FITC-coniugato IgG anti-coniglio. Incubare le cellule in ghiaccio per 1 ora al buio. Rimuovere la IgG lavando le cellule con PBS sterile 3 volte.
   9. Aggiungere Hoechst 33342 alla concentrazione finale di 1 mg / ml, incubare 10 minuti al buio.
   10. Vista la fluorescenza di CD31, VEGFR2, eNOS, VE-caderina, calponin (verde, di eccitazione lunghezza d'onda di 518-535 nm) e Hoechst (blu, l'eccitazione lunghezza d'onda di 361 nm) con un microscopio a fluorescenza invertito.

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Risultati

Endoteliale Cavolo cellulare

Spontanea delle cellule endoteliali germogliamento ha iniziato da un segmento del mouse dell'aorta. Il segmento del mouse aorta è stato permesso di crescere su una matrice fattore di crescita ridotto poi nel terreno di crescita endoteliale per 4 giorni. La germinazione delle cellule endoteliali di solito appare in 2 - 4 giorni. Microfotografie sono state scattate il giorno 4 (Figura 1). Come mostrato nelle immagini, numerose...

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Discussione

Questo studio dimostra un metodo semplice per isolare e cultura endoteliali cellule da una aorta mouse senza particolari attrezzature. La colorazione immunofluorescenza indicato che la maggior parte delle cellule erano cellule endoteliali dopo il secondo passaggio. Si suggerisce che le cellule in seconda al terzo passaggio sono adatti in vitro e in vivo per studiare biologia endoteliale.

Le note principali del protocollo Presente

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
4- or 6-week-old mice	Jackson Laboratory	#000664
Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	#10010-023
Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin	Sigma Aldrich	H3149
Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122])
Growth factor reduced matrix	BD Biosciences	356231
Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032)
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL)	Life Technologies	L3484
FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin)	Sigma	L9006
Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody	BD Biosciences	553372
Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody	Cell Signaling	9698
Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase	Abcam	ab5589
Anti-mouse vascular endothelium-cadherin	Abcam	33168
Anti-mouse calponin	Abcam	700
FITC-conjugated anti-rabbit IgG	Sigma	F6005
1 mL syringe fitted with 25-G needle	Fisher Scientific	50-900-04222
100 mm Peri dishes	Fisher Scientific	07-202-516
Six-well cell culture plates	Fisher Scientific	08-772-1B
T12.5 culture flask	Fisher Scientific	50-202-076
Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade	Fine Science Tools, Inc.
Anesthesia machine with isoflurane	Webster Veterianary Supply	07-806-3204
heating lamp
Centrifuge machine
Inverted phase-contrast microscope
inverted fluorescence microscope