Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

Zusammenfassung

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Zusammenfassung

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Einleitung

Das vaskuläre Endothel nicht nur eine Barriereschicht ist , die Blut und Gewebe trennt, wird eine große endokrine Drüse betrachtet , die mit einer Oberfläche von 400 Quadratmetern ¹ über den gesamten Gefäßbaum erstreckt. Das Wohlbefinden des Endothels ist wesentlich für vaskuläre Homöostase. Die dysfunktionalen Endothels beteiligt sich an verschiedenen kardiovaskulären Erkrankungen wie Atherosklerose, Vaskulitis und Ischämie / Reperfusion Verletzungen, usw. ^2-4. Bis heute sind die spezifischen zellulären und molekularen Mechanismen in dieser Krankheitseinstellungen beteiligt sind nicht gut verstanden durch die diffuses anatomischen Natur des Endothels.

Die Maus ist ein wichtiges Modell für die Forschung, da genetische Manipulationstechniken mehr bei Mäusen entwickelt als in jeder anderen Säugetierspezies. Jedoch ist die Isolierung von primären Maus-Aorta-Endothelzellen als besonders schwierig, da die geringe Größe der Aorta enzymat machtic Verdauung von Endothel nicht praktikabel. Einige Verfahren berichtet , zu isolieren und zu reinigen ECs ^5-7 erfordern.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein einfaches Verfahren zu verwenden, um Endothelzellen aus der Maus Aorta zu isolieren und zu erweitern, ohne eine spezielle Ausrüstung. In diesem Protokoll wird die frisch isolierten Aorta in kleine Segmente geschnitten und ausgesät auf einer Matrix mit dem Endothel für endothelial Austrieb zu ermöglichen nach unten zeigt. Nach Segmenten entfernt werden, werden Endothelzellen in Endothel-bevorzugtes Medium erweitert und sind für Experimente nach zwei oder drei Passagen bereit. Die Vorteile des beschriebenen Verfahrens sind, dass: 1) beträchtlich hohe Anzahl von Endothelzellen aus einer einzigen Aorta geerntet werden; 2) die Lebensfähigkeit der Zellen ist gut erhalten; und 3) keine spezielle Ausrüstung oder Technik erforderlich ist. Sie stellt ein wirksames Mittel zur spezifischen zellulären und molekularen Mechanismen in Endothelzellen Pathophysiologie identifizieren. Für diejenigen, die bei der Untersuchung pr interessiert sindimary kultivierten Endothelzellen aus entweder Gen-Knock-out-Mäuse, Gen-Knock-in-Mäusen, oder einem murinen Krankheitsmodell ist dieses Protokoll sehr nützlich und leicht zu praktizieren.

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Protokoll

1. Isolierung von Aorta von Mäusen

Alle hier beschriebenen Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee von der Wayne State University genehmigt.

1. Setzen Sie die Maus in die Induktionskammer der Anästhesiemaschine. Stellen Sie die Isofluran - Flow auf 4% in Verbindung mit 25% Frischluft und 75% O _2. Anesthetize die Maus durch Inhalation von Isofluran (4% für die Induktion, ± 1,0% für die Wartung) in Verbindung mit 25% Frischluft und 75% O ₂ über Induktionskammer durch einen eigenen Bugnase gefolgt. HINWEIS: Anästhesie mit Isofluran kann in 75% Sauerstoff / 25% Luft oder 100% Sauerstoff zugeführt werden.
2. Überprüfen Sie die Maus alle 5 Minuten, bis die angemessene Höhe der Anästhesie erreicht ist (Mangel an Rückzug bis Fuß Prise).
3. Nehmen Sie die Maus aus der Induktionskammer und weiter Isofluran Inhalation obwohl die spezielle Nasenkegel, die mit dem Anästhesiegerät angeschlossen ist. Schalten Sie dieIsofluran fließen zu 1% Anästhesie aufrechtzuerhalten.
4. Während es unter Narkose ist, legen Sie die Maus auf eine Operation Pad, auf dem Rücken positioniert. Verwenden Labor Band, die Glieder zu sichern.
5. Verwenden Sie eine Wärmelampe die Maus warm zu halten. Halten Sie die Lampe in einem angemessenen Abstand von der Maus, so dass die Maus nicht überhitzen.
6. Sprühen Sie die Brust mit 70% Ethanol.
7. Verwenden Sie Dissektion Schere den Bauch von der Mittellinie zu öffnen und die Bauchaorta aussetzen. Öffnen Sie die Brusthöhle und setzen das Herz und die Lunge.
8. Schneiden Sie die Bauchaorta in der Mitte mit Dissektion Schere, um das Blut zu lösen.
9. Füllen einer 1 ml Spritze (25 G Nadel) mit 1 ml PBS, enthaltend 1,000 U / ml Heparin. Injizieren PBS, enthaltend 1,000 U / ml Heparin zu dem linken Ventrikel und die Aorta perfundieren. Schieben Sie das Herz und die Lunge mit einer Pinzette an den großen Arterien auf die rechte Seite der Mäuse der thorakalen Aorta zu belichten.
10. Entfernen Sie schnell die Brustaorta Mikro di mitssection Zange und legte sie in eiskaltem 1x PBS (steril), transportieren dann den Behälter in eine laminare Luftströmung Haube.
11. Legen Sie eine 1-ml-Spritze mit 25 G-Nadel in ein Ende der Aorta eingesetzt und sanft die Aorta mit eiskaltem PBS spülen das Blut zu entfernen.
12. Verwenden einer Pinzette Mikrodissektion so viel des anhänge Fettgewebe und kleine seitliche Gefäße wie möglich zu entfernen.
13. Unmittelbar nach der Aorta übertragen Wachstumsmedium an Endothelzellen.
14. Schneiden Sie die Aorta in 1 mm Ringe ein steriles Skalpell verwendet wird. Ernte etwa 8 - 10 Ringe pro Aorta.
15. Öffnen Sie jeden Aorten-Ring ein Paar von Mikro-Dissektion Schere.

2. Seed die Aorten-Segmente auf Matrix

1. Wenn nicht in Gebrauch, halten den Wachstumsfaktor reduzierte Matrix in 20 ° C Erstarrungs zu verhindern. Setzen Sie den Wachstumsfaktor reduzierte Matrix in 4 ° C mindestens über Nacht ein komplettes Tauwetter zu ermöglichen.
2. Vorkühlung eine 6-Well-Platte und Pipettenspitzen bis -20 ° C für mindestens10 Minuten. Legen Sie die 6-Well-Platte auf Eis und Mantel eine Vertiefung der Platte mit 1 ml Matrix ohne Luftblasen einzuführen. Die Platte wird in einem 37 ° C Inkubator für 20 Minuten die Matrix zu ermöglichen, sich zu verfestigen.
3. Implantieren Sie die Aorten-Stücke auf die verfestigte Matrix mit sterilen Mikro-Dissektion Pinzette. Legen Sie die Stücke Lumen-Seite nach unten auf die Matrix ohne das Endothel zu berühren. Platzieren von 3 bis 4 aortic Segmente nahe beieinander auf der Matrix.
4. In gerade genug endothelialen Zellwachstumsmedium zu halten Segmente nass (~ 200 ul).
5. Inkubieren der Platte bei 37 ° C unter 5% CO ₂ für 4 bis 6 h. Am Ende des Tages, fügen Sie einfach genug Medium die Aorten-Segmente abzudecken.
6. Beachten Sie die Aorten-Segment in regelmäßigen Abständen unter einem Phasenkontrastmikroskop sprießen. Überprüfen mittleren Ebene und das Zellwachstum pro Tag. In Medium bei Bedarf abgedeckt Aorten-Segmente zu halten.
7. Am ^4. Tag, entfernen Sie das Medium und entfernen Sie die Aorten - Segmente fROM mit der Matrix mit einer sterilen Nadel ohne die wachsenden Endothelzellen zu unterbrechen.
8. In 2 ml neuen endothelialen Zellwachstumsmedium und damit die Endothelzellen weiterhin auf Matrix 2 zu vermehren - 3 Tage.

3. Erste Passagierung der Maus Aortic Endothelial Cells

1. Mantel ein neuer T12.5 Kolben mit Gelatine (0,1%) für 30 min bei 37 ° C inkubieren.
2. Waschen Sie die Matrixplatten vorsichtig mit sterilem PBS 37 ° C.
3. In 2 ml neutralen Proteinase (50 U / ml) auf die Matrixplatten und Inkubation bei Raumtemperatur auf Wippschüttler mit gelegentlichem Schütteln. Schauen Sie sich die Zellen unter einem Phasenkontrastmikroskop die Mehrzahl der Zellen, um sicherzustellen, abgelöst werden.
4. 2 mL D-Val in die neutrale Proteinase zu inaktivieren.
5. Sammeln Sie den Überstand vorsichtig in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Platte mit 2 ml D-Val und sammeln den Überstand.
6. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 900 g für 5 min bei room Temperatur.
7. Resuspendieren des Zellpellets in 4 ml Endothelzellen-Wachstumsmedium und der Platte in dem T12.5 Kolben mit Gelatine beschichtet. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 2 h.
8. Ersetzen Sie das Medium. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ , bis sie 85% - 90% konfluent.

4. Passagierung der Maus Aortic Endothelial Cells

1. Mantel zwei neue T12.5 Kolben mit Gelatine (0,1%) für 30 min bei 37 ° C inkubieren. Vorheizen Trypsin-EDTA (0,25% Trypsin, 0,02 EDTA in PBS) und sterile PBS bei 37 ° C für etwa 15 min.
2. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit einer sterilen 37 ° C PBS.
3. In 0,5 ml Trypsin-EDTA (0,25% Trypsin, 0,02 EDTA in PBS) und Inkubation bei 37 ° C für ca. 1 min oder bis die Mehrzahl der Zellen umdrehen.
4. 2 mL endothelialen Zellwachstumsmedium, das die Verdauung zu stoppen. Pipette die Zellsuspension nach oben und unten in den Kolben mehrmals. Verwenden Sie bei Bedarf eine ZelleSchaber um die Zellen zu sammeln.
5. Sammeln der Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 900 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Resuspendieren des Zellpellets in 4 ml Endothelzellen-Wachstumsmedium und der Platte in 2 T12.5 Kolben mit Gelatine beschichtet. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 2 h.
7. Ersetzen Sie das Medium. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ , bis sie 85% - 90% konfluent.
8. Verwenden Sie die Maus Aorten-Endothelzellen nach 2 - 3 Passagen.

5. Charakterisierung der Maus Aortic Endothelial Cells

1. Re-Platte die Zellen.
   1. Mantel eine 6-well-Platte mit Gelatine (0,1%) für 30 min bei 37 ° C inkubieren. Spülen Sie die Platte mit PBS.
   2. Vorheizen Trypsin-EDTA und sterilem PBS auf 37 ° C für etwa 15 min.
   3. Waschen Sie die Zellen mit steriler PBS 3 mal. In 0,5 ml Trypsin / EDTA zu den Zellen, Inkubation für ca. 1 min bei 37 ° C or, bis die Mehrheit der Zellen umdrehen.
   4. 2 mL endothelialen Zellwachstumsmedium, das die Verdauung zu stoppen. Pipette die Zellsuspension nach oben und unten in den Kolben mehrmals. Verwenden Sie bei Bedarf einen Zellschaber um die Zellen zu sammeln.
   5. Sammeln der Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 900 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
   6. Überstand verwerfen, wieder die Zellen in endothelialen Zellwachstumsmedium. Samen , die Zellen in 6-Well - Platte , beschichtet mit Gelatine in einer Dichte von 3 x 10 ⁵ / Vertiefung.
   7. Inkubieren der Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5% CO ₂ werden die Zellen zu erlauben , auf die Kulturoberfläche zu befestigen.
2. Dil-Ac-LDL uptaken und Ulex -lectin Bindung.
   1. Bewahren Sie die 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'- tetramethylindo-Carbocyaninfarbstoffes Perchlorat-markierten acetyliertes LDL (Dil-Ac-LDL) bei -20 ° C. Vor dem Färben, auftauen Dil-Ac-LDL auf Eis. Die Aktie Dil-Ac-LDL solution beträgt 1 mg / mL. Lagern Sie den FITC-markierten Ulex europaeus Agglutinin (Ulex -Lectin, 1 & mgr; g / ml) bei 4 ° C. Die Aktie Ulex -Lectin Lösung beträgt 1 mg / ml. Store Hoechst 33342 bei 4 ° C. Die Aktie Hoechst 33342 Lösung ist 100 ug / ml.
   2. Fügen Sie 10 & mgr; l von Dil-Ac-LDL-Stammlösung auf 1 ml Kulturmedium in einer Endkonzentration von 10 ug / ml zu erhalten.
   3. Vor der Färbung, entfernen Sie das alte Medium und waschen Sie die Zellen in jeder Vertiefung mit neuen Medium.
   4. Nehmen Sie das neue Medium und fügen Sie die Dil-Ac-LDL-Färbung Medium.
   5. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ für 1 h.
   6. Waschen der Zellen mit sterilem PBS 1x 3 mal.
   7. 1 ml 10% Formalin, die Zellen zu fixieren. Legen Sie die Platte in Raumtemperatur für etwa 30 min.
   8. Waschen der Zellen mit sterilem PBS 1x 3 mal. Vermeiden Sie Licht.
   9. In 1 ml sterile 1x PBS , die 10 & mgr; l von Ulex -Lectin enthält.
   10. Inkubieren Sie die Zellen bei Raum temperature im Dunkeln für 1 h.
   11. Entfernen Sie die Ulex-Lektin, indem die Zellen mit steriler PBS 1x 3-mal gewaschen wurde.
   12. Hinzufügen Hoechst 33342 bis zu einer Endkonzentration von 1 ug / ml, 10 min Inkubieren im Dunkeln.
   13. Sehen Sie sich die Fluoreszenz von Dil-Ac-LDL (rot, Anregungswellenlänge von 576 nm), Ulex -Lectin (grün, Anregungswellenlänge von 519 nm) und Hoechst (blau, Anregungswellenlänge von 361 nm) mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop.
3. Fluoreszenzfärbung für CD31, VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin und Calponin.
   1. Store FITC-konjugiertem anti-Maus-CD31-Antikörper, Antikörper eNOS, VE-Cadherin-Antikörper FITC-konjugiertem anti-Kaninchen-IgG bei 4 ° C im Dunkeln. Store VEGFR2 Antikörper in -20 ° C.
   2. Waschen der Zellen mit sterilem PBS 1x 3 mal.
   3. 1 ml 10% Formalin, die Zellen zu fixieren. Legen Sie die Platte in Raumtemperatur für etwa 30 min.
   4. Waschen der Zellen mit sterilem PBS 1x 3 mal.
   5. Beflecken CD31, 1 ml steriler 1xPBS, das 10 & mgr; l von CD31-FITC-Antikörper enthält. Um Fleck entweder VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin oder Calponin, 1 mL sterile 1x PBS, die 4 ul VEGFR2 enthält, eNOS, VE-Cadherin oder Calponin primären Antikörper sind.
   6. Inkubieren der Zellen auf Eis für 1 h in der Dunkelheit.
   7. Entfernen der Antikörper, die durch die Zellen mit steriler PBS 3 mal waschen.
   8. Für die Färbung von VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin oder Calponin, 1 ml steriler 1x PBS, das 10 & mgr; l FITC-konjugiertem anti-Kaninchen-IgG enthält. Inkubieren der Zellen auf Eis für 1 h in der Dunkelheit. Entfernen Sie die IgG, indem die Zellen mit steriler PBS 3 mal waschen.
   9. Hinzufügen Hoechst 33342 bis zu einer Endkonzentration von 1 ug / ml, 10 min Inkubieren im Dunkeln.
   10. Sehen Sie sich die Fluoreszenz von CD31, VEGFR2, eNOS, VE-Cadherin, Calponin (grün, Anregungswellenlänge von 518 bis 535 nm) und Hoechst (blau, Anregungswellenlänge von 361 nm) mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop.

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Ergebnisse

Endothelzell Sprießen

Spontane Endothelzellen aus einem Maus-Aorta-Segment gestartet sprießen. Die Maus-Aorta-Segment wurde für 4 Tage auf einem Wachstumsfaktor-reduzierte Matrix dann in endothelialen Zellwachstumsmedium wachsen gelassen. Die Endothelzellen Austrieb erscheint in der Regel innerhalb von 2 - 4 Tage. Photomikrographien wurden am Tag 4 (Figur 1) aufgenommen. Wie in den Abbildungen gezeigt, wandern zahlreiche Endothelzellen aus dem Segment ent...

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Diskussion

Diese Studie zeigt, ein einfaches Verfahren zur Isolierung und Kultur Endothelzellen von einer Maus Aorta ohne spezielle Ausrüstung. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte, daß die Mehrzahl der Zellen Endothelzellen nach dem zweiten Durchgang waren. Es wird vorgeschlagen , dass die Zellen am zweiten in den dritten Durchgang geeignet sind , in vitro und in vivo Experimenten endothelial biology zu studieren.

Die EVP - ED aus dem Protokoll

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
4- or 6-week-old mice	Jackson Laboratory	#000664
Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	#10010-023
Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin	Sigma Aldrich	H3149
Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122])
Growth factor reduced matrix	BD Biosciences	356231
Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032)
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL)	Life Technologies	L3484
FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin)	Sigma	L9006
Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody	BD Biosciences	553372
Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody	Cell Signaling	9698
Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase	Abcam	ab5589
Anti-mouse vascular endothelium-cadherin	Abcam	33168
Anti-mouse calponin	Abcam	700
FITC-conjugated anti-rabbit IgG	Sigma	F6005
1 mL syringe fitted with 25-G needle	Fisher Scientific	50-900-04222
100 mm Peri dishes	Fisher Scientific	07-202-516
Six-well cell culture plates	Fisher Scientific	08-772-1B
T12.5 culture flask	Fisher Scientific	50-202-076
Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade	Fine Science Tools, Inc.
Anesthesia machine with isoflurane	Webster Veterianary Supply	07-806-3204
heating lamp
Centrifuge machine
Inverted phase-contrast microscope
inverted fluorescence microscope