L'isolement et la culture primaire de cellules endothéliales aortiques de souris

Résumé

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Résumé

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Introduction

L'endothélium vasculaire est non seulement une couche barrière qui sépare le sang et les tissus, on considère une vaste glande endocrine qui étend sur la totalité de l' arbre vasculaire avec une surface spécifique de 400 mètres carrés ^1. Le bien-être de l'endothélium est essentiel à l'homéostasie vasculaire. L'endothélium dysfonctionnel participe à divers troubles cardiovasculaires, y compris l' athérosclérose, la vasculite et les blessures d' ischémie / reperfusion, etc. ^2-4. À ce jour, les mécanismes cellulaires et moléculaires spécifiques impliqués dans ces paramètres de la maladie ne sont pas bien comprises en raison de la nature anatomique diffuse de l'endothélium.

La souris est un modèle important pour la recherche parce que les techniques de manipulation génétique sont plus développés chez les souris que chez les autres espèces de mammifères. Cependant, l'isolement des cellules endothéliales aortiques murins primaires est considérée comme particulièrement difficile en raison de la petite taille de l'aorte fait enzymatic digestion de l'endothélium impraticable. Certaines procédures pour isoler et purifier CEs nécessitent ^5-7 signalé.

L'objectif de ce protocole est d'utiliser une méthode simple pour isoler et développer les cellules endothéliales de l'aorte de la souris sans utiliser aucun équipement spécial. Dans ce protocole, l'aorte fraîchement isolée est coupée en petits segments et ensemencées sur une matrice avec l'endothélium vers le bas pour permettre la germination endothéliale. Après segments sont enlevés, les cellules endothéliales sont développées dans le milieu de l'endothélium favorisée et sont prêts pour des expériences après deux ou trois passages. Les avantages du procédé décrit sont les suivants: 1) des nombres très élevés de cellules endothéliales sont récoltées à partir d'une seule aorte; 2) la viabilité des cellules est bien conservé; et 3) aucun équipement ou d'une technique spéciale est nécessaire. Il fournit un moyen efficace d'identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires spécifiques dans la physiopathologie des cellules endothéliales. Pour ceux qui sont intéressés à étudier prles cellules endothéliales cultivées imary provenant soit des souris knock-out, le gène souris knock-in, ou un modèle murin de la maladie, ce protocole est très utile et facile à pratiquer.

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Protocole

1. Isolement de l'aorte de souris

Toutes les procédures décrites ici ont été approuvés par le soin et l'utilisation des animaux Commission institutionnelle de l'Université Wayne State.

1. Placer la souris dans la chambre d'aspiration de la machine d'anesthésie. Régler le débit de l' isoflurane à 4% en conjonction avec 25% d' air frais et de 75% de O _2. Anesthetize la souris par inhalation d'isoflurane (4% pour l' induction, ± 1,0% pour la maintenance) en conjonction avec 25% d' air frais et de 75% O ₂ par chambre d'induction suivie d'un cône de nez dédié. NOTE: L'anesthésie avec de l'isoflurane peut être livré dans 75% d'oxygène / 25% d'air ou 100% d'oxygène.
2. Vérifiez la souris toutes les 5 min jusqu'à ce que le niveau approprié de l'anesthésie est atteinte (absence de retrait pincement de l'orteil).
3. Prendre la souris hors de la chambre d'induction et continuer l'isoflurane par inhalation si le cône de nez dédié qui est connecté à la machine d'anesthésie. Mettez leisoflurane écoulement à 1% pour maintenir l'anesthésie.
4. Alors qu'il est sous anesthésie, mettez la souris sur un bloc de chirurgie, positionné sur son dos. Utilisez du ruban de laboratoire pour sécuriser les membres.
5. Utilisez une lampe chauffante pour maintenir la chaleur de la souris. Gardez la lampe à une distance appropriée de la souris pour que la souris ne sera pas trop de chaleur.
6. Vaporiser la poitrine avec 70% d'éthanol.
7. Utilisez des ciseaux de dissection pour ouvrir l'abdomen de la ligne médiane, et d'exposer l'aorte abdominale. Ouvrez la cavité thoracique et d'exposer le cœur et les poumons.
8. Couper l'aorte abdominale au milieu avec des ciseaux de dissection pour libérer le sang.
9. Remplir une seringue de 1 ml (avec 25 aiguille G) avec 1 mL de PBS contenant 1 000 U / ml d'héparine. Injecter du PBS contenant 1 000 U / ml d'héparine dans le ventricule gauche et perfuser l'aorte. Poussez le cœur et le poumon avec une pince sur les grandes artères du côté droit de la souris pour exposer l'aorte thoracique.
10. Retirez rapidement l'aorte thoracique à l'aide de micro-dipinces ssection et le mettre dans la glace froide 1x PBS (stérile), puis transporter le conteneur dans une hotte à flux laminaire.
11. Insérez une seringue de 1 ml équipé 25 aiguille G dans une extrémité de l'aorte, et rincer doucement l'aorte avec PBS glacé pour enlever le sang.
12. Utilisez une pince micro-dissection pour enlever autant du tissu adipeux ci-joint et de petits vaisseaux latéraux que possible.
13. transférer immédiatement l'aorte endothéliales milieu de croissance.
14. Couper l'aorte en 1 mm anneaux à l'aide d'une lame de scalpel stérile. Récolte environ 8 - 10 anneaux par aorte.
15. Ouvrez chaque anneau aortique en utilisant une paire de ciseaux micro-dissection.

2. Seed les Segments aortiques sur matrice

1. Lorsqu'ils ne sont pas en cours d'utilisation, maintenir la matrice de facteur réduit la croissance de -20 ° C pour empêcher la solidification. Placer la matrice de facteur de croissance réduite à 4 ° C au moins pendant une nuit pour permettre une décongélation complète.
2. Prérefroidissement un 6 puits conseils de plaque et de pipettes à -20 ° C pendant au moins10 minutes. Mettez la plaque de 6 puits sur la glace et le manteau d'un puits de la plaque avec 1 ml de matrice sans introduire de bulles d'air. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 20 min pour permettre à la matrice de se solidifier.
3. Implanter les morceaux de l'aorte sur la matrice solidifiée en utilisant une pince micro-dissection stériles. Placez les morceaux du côté lumière vers le bas sur la matrice sans toucher l'endothélium. Place 3 - 4 segments aortiques proches les uns des autres sur la matrice.
4. Ajoutez juste assez milieu de croissance des cellules endothéliales pour maintenir les segments humide (~ 200 pi).
5. Incuber la plaque à 37 ° C sous 5% de CO ₂ pendant 4 à 6 heures. A la fin de la journée, ajoutez juste assez moyen pour couvrir les segments de l'aorte.
6. Observez le segment aortique germination périodiquement sous un microscope à contraste de phase. Vérifier le niveau moyen et la croissance cellulaire chaque jour. Ajouter moyen si nécessaire pour maintenir les segments aortiques couverts.
7. Sur le 4 ^ème jour, retirez délicatement le moyen et retirer les segments de l' aorte felon la matrice à l'aide d'une aiguille stérile sans interrompre les cellules endothéliales en croissance.
8. Ajouter 2 ml de nouveau milieu de croissance des cellules endothéliales et les cellules endothéliales permettent continuent de proliférer sur la matrice 2 - 3 jours.

3. repiquage initial des cellules endothéliales aortiques Souris

1. Enduire un nouveau flacon de T12.5 avec de la gélatine (0,1%), incuber à 37 ° C pendant 30 min.
2. Laver les plaques de matrice avec soin stérile 37 ° C PBS.
3. Ajouter 2 mL de proteinase neutre (50 U / ml) sur les plaques de matrice et incuber à température ambiante sur la plate-forme rocker avec agitation occasionnelle. Vérifiez les cellules sous un microscope à contraste de phase pour vous assurer que la majorité des cellules sont détachés.
4. Ajouter 2 mL de D-Val pour inactiver la proteinase neutre.
5. Recueillir le surnageant avec précaution dans un tube de 15 ml centrifugeuse. Laver la plaque avec 2 ml D-Val et recueillir le surnageant.
6. Centrifuger la suspension cellulaire à 900 xg pendant 5 min à room température.
7. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 4 ml de milieu de croissance des cellules endothéliales et la plaque dans le flacon T12.5 enrobé avec de la gélatine. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO ₂ pendant 2 h.
8. Remplacez le support. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de _CO2 jusqu'à ce qu'elles soient 85% - 90% de confluence.

4. repiquage des cellules endothéliales aortiques Souris

1. Manteau deux nouvelles fioles de T12.5 avec de la gélatine (0,1%), incuber à 37 ° C pendant 30 min. Pré-chauffage de la trypsine-EDTA (0,25% de trypsine, 0,02 EDTA dans du PBS) et du PBS stérile à 37 ° C pendant environ 15 min.
2. Laver les cellules avec soin stérile 37 ° C PBS.
3. Ajouter 0,5 ml de Trypsine-EDTA (0,25% de trypsine, 0,02 EDTA dans du PBS) et incuber à 37 ° C pendant environ 1 minute ou jusqu'à ce que la majorité des cellules se retourner.
4. Ajouter 2 mL de milieu de croissance des cellules endothéliales pour arrêter la digestion. Introduire à la pipette la suspension de cellules et vers le bas dans le temps de plusieurs flacons. Si nécessaire, utilisez une cellulegrattoir pour recueillir les cellules.
5. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Centrifuger la suspension cellulaire à 900 g pendant 5 min à température ambiante.
6. Remettre en suspension le culot cellulaire dans 4 ml de milieu de croissance des cellules endothéliales et de la plaque dans des ballons de 2 T12.5 revêtues de gélatine. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO ₂ pendant 2 h.
7. Remplacez le support. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de _CO2 jusqu'à ce qu'elles soient 85% - 90% de confluence.
8. Utiliser les cellules endothéliales aortiques de souris après 2 - 3 passages.

5. Caractérisation des cellules endothéliales aortiques de souris

1. Re-plaque les cellules.
   1. Enduire une plaque à 6 puits avec de la gélatine (0,1%), incuber à 37 ° C pendant 30 min. Rincer la plaque avec du PBS.
   2. Préchauffer la trypsine-EDTA et du PBS stérile à 37 ° C pendant environ 15 min.
   3. Laver les cellules avec du PBS stérile 3 fois. Ajouter 0,5 ml de solution de trypsine / EDTA pour les cellules, incuber pendant environ 1 min à 37 ° C or jusqu'à ce que la majorité des cellules se retourner.
   4. Ajouter 2 mL de milieu de croissance des cellules endothéliales pour arrêter la digestion. Introduire à la pipette la suspension de cellules et vers le bas dans le temps de plusieurs flacons. Si nécessaire, utiliser un grattoir cellulaire pour recueillir les cellules.
   5. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml de la centrifugeuse. Centrifuger la suspension cellulaire à 900 g pendant 5 min à température ambiante.
   6. Jeter le surnageant, remettre en suspension les cellules dans un milieu de croissance des cellules endothéliales. Ensemencer les cellules en plaque de 6 puits revêtus avec de la gélatine à la densité de 3 x 10 ⁵ / puits.
   7. Incuber les cellules pendant une nuit à 37 ° C, 5% de CO ₂ pour permettre aux cellules de se fixer à la surface de culture.
2. Dil-ac-LDL uptaken et Ulex -lectin liaison.
   1. Stocker le 1,1'-dioctadécyl-3,3,3 ', 3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate marqué LDL acétylé (Dil-ac-LDL) à -20 ° C. Avant la coloration, dégeler Dil-ac-LDL sur la glace. La solu Stock Dil-ac-LDLtion est de 1 mg / ml. Stocker le europaeus agglutinine marqué FITC Ulex (Ulex -Lectin, 1 pg / ml) à 4 ° C. La solution stock Ulex -Lectin est de 1 mg / mL. Magasin Hoechst 33342 à 4 ° C. La 33342 solution mère Hoechst est de 100 pg / mL.
   2. Ajouter 10 ul d'Dil-ac-LDL solution mère à 1 ml de milieu de culture pour obtenir une concentration finale de 10 pg / ml.
   3. Avant coloration, retirez l'ancien milieu et laver les cellules dans chaque puits par un nouveau milieu.
   4. Retirez le nouveau moyen et ajouter le milieu de coloration Dil-ac-LDL.
   5. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% de CO ₂ pendant 1 h.
   6. Laver les cellules avec stériles 1x PBS 3 fois.
   7. Ajouter 1 ml de formol à 10% pour fixer les cellules. Mettre la plaque dans la température ambiante pendant environ 30 min.
   8. Laver les cellules avec stériles 1x PBS 3 fois. Évitez la lumière.
   9. Ajouter 1 mL stérile 1x PBS qui contient 10 pi de Ulex -Lectin.
   10. Incuber les cellules à chambre tempérare dans l'obscurité pendant 1 h.
   11. Retirer la Ulex lectine-en lavant les cellules avec du PBS stérile 1x 3 fois.
   12. Ajouter de Hoechst 33342 à une concentration finale de 1 pg / ml, incuber pendant 10 minutes dans l'obscurité.
   13. Voir la fluorescence de Dil-ac-LDL (rouge, excitation longueur d'onde de 576 nm), Ulex -Lectin (vert, excitation longueur d'onde de 519 nm) et Hoechst (bleu, excitation longueur d'onde de 361 nm) avec un microscope à fluorescence inversé.
3. coloration fluorescente pour CD31, VEGFR2, eNOS, VE-cadhérine et calponine.
   1. Magasin de l'anticorps conjugué au FITC anti-souris CD31, un anticorps eNOS, la VE-cadhérine anticorps, conjugué à FITC IgG anti-lapin à 4 ° C dans l'obscurité. Magasin VEGFR2 anticorps -20 ° C.
   2. Laver les cellules avec stériles 1x PBS 3 fois.
   3. Ajouter 1 ml de formol à 10% pour fixer les cellules. Mettre la plaque dans la température ambiante pendant environ 30 min.
   4. Laver les cellules avec stériles 1x PBS 3 fois.
   5. Pour colorer CD31, ajouter 1 ml de 1x stérilePBS contenant 10 pi d'anticorps CD31-FITC. Pour colorer soit VEGFR2, eNOS, VE-cadhérine ou calponin, ajouter 1 ml de solution stérile 1x PBS contenant 4 pi de VEGFR2, eNOS, VE-cadhérine ou calponin anticorps primaire, respectivement.
   6. Incuber les cellules sur de la glace pendant 1 h dans l'obscurité.
   7. Retirer les anticorps par lavage des cellules avec du PBS stérile 3 fois.
   8. Pour la coloration de VEGFR2 eNOS, la VE-cadhérine ou calponin, ajouter 1 ml de solution stérile PBS 1x contenant 10 ul de FITC conjugué IgG anti-lapin. Incuber les cellules sur de la glace pendant 1 h dans l'obscurité. Éliminer les IgG en lavant les cellules avec du PBS stérile 3 fois.
   9. Ajouter de Hoechst 33342 à une concentration finale de 1 pg / ml, incuber pendant 10 minutes dans l'obscurité.
   10. Voir la fluorescence de CD31, VEGFR2, eNOS, VE-cadhérine, calponin (vert, excitation longueur d'onde de 518-535 nm) et Hoechst (bleu, excitation longueur d'onde de 361 nm) avec un microscope à fluorescence inversé.

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Résultats

Cellules endothéliales Germination

cellules endothéliales spontanée germination a commencé à partir d'un segment d'aorte de souris. Le segment d'aorte de souris a été autorisée à se développer sur une matrice de facteurs de croissance, puis réduit dans un milieu de croissance des cellules endothéliales pendant 4 jours. La germination des cellules endothéliales apparaît généralement dans 2 - 4 jours. Photomicrographies ont été prises le jour 4

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Discussion

Cette étude démontre une méthode simple pour isoler et cultiver des cellules endothéliales d'une aorte de souris sans aucun équipement spécial. La coloration par immunofluorescence a indiqué que la majorité des cellules sont des cellules endothéliales après le second passage. Il est suggéré que les cellules au deuxième à la troisième passage sont adaptés pour in vitro et in vivo des expériences pour étudier la biologie endothéliale.

Les billet...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
4- or 6-week-old mice	Jackson Laboratory	#000664
Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	#10010-023
Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin	Sigma Aldrich	H3149
Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122])
Growth factor reduced matrix	BD Biosciences	356231
Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032)
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL)	Life Technologies	L3484
FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin)	Sigma	L9006
Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody	BD Biosciences	553372
Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody	Cell Signaling	9698
Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase	Abcam	ab5589
Anti-mouse vascular endothelium-cadherin	Abcam	33168
Anti-mouse calponin	Abcam	700
FITC-conjugated anti-rabbit IgG	Sigma	F6005
1 mL syringe fitted with 25-G needle	Fisher Scientific	50-900-04222
100 mm Peri dishes	Fisher Scientific	07-202-516
Six-well cell culture plates	Fisher Scientific	08-772-1B
T12.5 culture flask	Fisher Scientific	50-202-076
Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade	Fine Science Tools, Inc.
Anesthesia machine with isoflurane	Webster Veterianary Supply	07-806-3204
heating lamp
Centrifuge machine
Inverted phase-contrast microscope
inverted fluorescence microscope