İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

Özet

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Özet

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Giriş

Vasküler endotelyum, sadece kan ve doku ayıran bir bariyer tabakası, bir 400 metre kare ¹ kadar bir yüzey alanı ile damar ağacı boyunca uzanır geniş bir endokrin bezi olarak kabul edilir. endotel refahını damar homeostazının için gereklidir. Disfonksiyonel endotel ateroskleroz, vaskülit ve iskemi / reperfüzyon yaralanması gibi ^2-4 dahil olmak üzere çeşitli kardiyovasküler bozuklukların, katılır. Bugüne kadar, bu hastalık ayarlarında yer alan spesifik hücresel ve moleküler mekanizmalar iyi sonucu endotel dağınık anatomik yapısına anlaşılamamıştır.

Genetik manipülasyon teknikleri, diğer herhangi bir memeli türlerde daha farelerde geliştirilmektedir, çünkü, fare araştırmaları için önemli bir modeldir. Aort küçük boyutlu enzymat yapar çünkü Ancak, birincil fare aort endotel hücreleri izolasyonu özellikle zor olarak kabul edilirpratik endotel ic sindirimi. Bazı izole ve EC ^5-7 gerektirir arındırmak için prosedürler bildirdi.

Bu protokolün amacı, herhangi bir özel ekipman kullanmadan fare aorta endotel hücreleri izole ve genişletmek için basit bir yöntem kullanmaktır. Bu protokol, yeni izole edilmiş aort küçük parçalar halinde kesilir ve endotel filizlenmesi için izin vermek için aşağı doğru dönük endotel ile bir matris üzerine tohumlandı. segmentler kaldırıldıktan sonra endotel hücreleri endotel tercih ortamda genişletildi ve iki ya da üç geçişten sonra deneyler için hazırdır. tarif edilen metodun avantajları: 1), tek bir aort hasat endotel hücrelerinin oldukça yüksek sayılar; 2) hücre canlılığı iyi korunmuştur; ve 3) hiçbir özel ekipman veya teknik gereklidir. Bu endotel hücre patofizyolojisinde spesifik hücresel ve moleküler mekanizmaların tanımlanması için etkili bir araç sağlar. pr okuyan ilgilenen olanlar içinHer iki gen knock-out farelerinden alınan imary kültürlenmiş endotel hücreleri, gen knock-fareler ya da bir fare hastalık modeli, bu protokol, çok kullanışlı ve pratik kolaydır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Fareler ile Aort 1. İzolasyonu

Burada anlatılan tüm işlemler Wayne State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1. anestezi makinesinin indüksiyon odasına fare koyun. % 25 taze hava ve% 75 O ₂ ile birlikte% 4 izofluran akışını ayarlayın. Özel bir burun konisi tarafından takip indüksiyon odasına aracılığıyla% 25 taze hava ve% 75 O ₂ ile birlikte izofluran (indüksiyon için% 4, bakım için 1.0 ±%) solunmasıyla fare anestezisi. NOT: izofluran ile Anestezi% 75 oksijen /% 25 hava veya% 100 oksijen teslim edilebilir.
2. Uygun anestezi düzeyi (ayak tutam çekilmesi eksikliği) ulaşılana kadar fareye her 5 dakikada kontrol edin.
3. indüksiyon odasının dışında fare alın ve anestezi makinesine bağlı olan özel burun konisi olsa izofluran inhalasyon devam ediyor. Anahtarıizofluran anestezi korumak için% 1 akar.
4. o anestezi altında iken, kendi arka yüzünde konumlandırılmış bir ameliyat ped, üzerine fare koymak. bacaklarda sabitlemek için laboratuvar bant kullanın.
5. Fare sıcak tutmak için bir ısıtma lambası kullanın. Fare olmaz aşırı ısı böylece fare uygun bir mesafe lamba tutun.
6. % 70 etanol ile göğüs püskürtün.
7. orta hattan karın açın ve abdominal aorta göstermek için diseksiyon makas kullanın. göğüs boşluğu açın ve kalp ve akciğerler maruz kalmaktadır.
8. kan serbest bırakmak için diseksiyon makas ile ortasında bulunan abdominal aorta kesin.
9. Heparin 1000 U / mL ihtiva eden 1 mL PBS (25 G iğne ile) 1 ml şırınga doldurun. sol ventrikül heparin 1,000 U / mL içeren PBS enjekte edilir ve aorta serpmek. aorta maruz farelerin sağ tarafına büyük arterlerde forseps ile kalp ve akciğer itin.
10. Hızla mikro-di kullanılarak aorta kaldırmakssection forseps ve buz gibi soğuk 1x PBS (steril) koymak, sonra bir laminer hava akımı kaputun içine kabı taşıma.
11. Aort bir ucuna 25 G iğne ile donatılmış bir 1 ml şırınga yerleştirin, yavaşça kan çıkarmak için buz soğukluğunda PBS ile aort yıkayın.
12. Mümkün olduğunca ekli yağ dokusunun çok küçük ve yan damarları kaldırmak için mikro diseksiyon forseps kullanabilir.
13. Hemen büyüme ortamı endotel aort aktarın.
14. steril bir neşter bıçak kullanarak 1 mm halkalar şeklinde aorta kesin. Hasat yaklaşık 8 - aort başına 10 yüzük.
15. Mikro-diseksiyon makas kullanarak her aort halka açın.

2. Tohum Matrix Aort Bölümleri

1. Kullanılmadığı, katılaşma önlemek için -20 ° C büyüme faktörü azaltılmış matris tutmak zaman. Tam çözülme izin vermek için en az bir gece süreyle 4 ° C'de büyüme faktörü azaltılmış matris koyun.
2. en az -20 ° C'de bir 6-yuvalı plaka ve pipet uçları ön soğutma10 dk. Herhangi bir hava baloncuklarının oluşumunu olmayan matris 1 mL plakanın buz ve kat üzerindeki bir 6 yuvalı plaka koyun. 20 dakika matris katılaşmaya izin için bir 37 ° C inkübatör plaka koyun.
3. Steril mikro diseksiyon forseps kullanılarak katılaşmış matris üzerine aort parçaları implante edin. endotel dokunmadan lümen tarafı aşağı matris üzerinde parçalarını yerleştirin. matris üzerinde birbirine yakın 4 aort segmentleri - 3 koyun.
4. (~ 200 uL), ıslak segmentleri tutmak için yeterli endotelyal hücre büyüme ortamı ilave edin.
5. 4 ila 6 saat boyunca% 5 _CO2 altında 37 ° C'de inkübe plakası. Günün sonunda, aort segmentleri kaplamak için yeterli miktarda ortam ilave edin.
6. Bir faz-kontrast mikroskop altında periyodik olarak çimlenme aort segmenti gözlemleyin. orta düzeyde ve hücre büyümesini her gün kontrol edin. örtülü aort segmentleri tutmak için gerekirse orta ekleyin.
7. ^4. gününde, yavaşça orta kaldırmak ve aort segmentleri f kaldırmakbüyüyen endotel hücrelerini kesmeden steril iğne kullanılarak matrisi rom.
8. Yeni endotel hücre büyüme ortamı 2 ml ilave edilir ve endotel hücreleri 2 matris üzerinde çoğalmaya devam etmesini - 3 gün.

Fare Aort Endotel Hücreleri 3. İlk Pasajlanması

1. Kat jelatin (% 0.1) ile birlikte, yeni bir T12.5 şişeye, 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
2. Steril 37 ° C PBS ile dikkatlice matris plakaları yıkayın.
3. Matris plakalarına nötr proteinazı (50 U / mL) 2 ml ilave edilir ve ara sıra çalkalanarak platform rocker oda sıcaklığında inkübe edin. Hücrelerin büyük çoğunluğu müstakil emin olmak için bir faz-kontrast mikroskop altında hücrelerin kontrol edin.
4. Nötr proteinaz inaktif D-Val 2 mL ekleyin.
5. 15 ml santrifüj tüpüne dikkatli bir şekilde supernatant toplamak. 2 mL D-Val ile plaka yıkayın ve süpernatant toplamak.
6. roo 5 dakika boyunca 900 x g'de hücre süspansiyonu santrifüjm sıcaklığı.
7. jelatin ile kaplanmış T12.5 şişede endotelyal hücre büyüme ortamı ve plakanın 4 mL hücre pelletini yeniden askıya. 2 saat boyunca 37 ° C,% 5 _CO2 hücreleri inkübe edin.
8. orta yerine. % 90 konfluent - bunlar% 85 kadar, 37 ° C'de,% 5 _CO2 hücreleri inkübe edin.

Fare aort endotel hücreleri 4. pasaj

1. Kat iki yeni T12.5 şişeler jelatin (% 0.1) ile birlikte, 30 dakika süre ile 37 ° C'de inkübe edin. yaklaşık 15 dakika boyunca 37 ° C'de ön ısıtma Tripsin-EDTA (% 0.25 tripsin, PBS içinde 0.02 EDTA) ve steril PBS ile yıkandı.
2. Steril 37 ° C PBS ile dikkatlice hücreleri yıkayın.
3. Tripsin-EDTA (% 0.25 tripsin, PBS içinde 0.02 EDTA), 0.5 ml ilave edilir ve yaklaşık 1 dakika ya da hücrelerin çoğunluğu boyunca edecek kadar 37 ° C'de inkübe edin.
4. sindirim durdurmak için endotelyal hücre büyüme ortamı 2 mL ekleyin. yukarı ve aşağı şişesi birkaç kez içinde hücre süspansiyonu pipetle. Gerekirse, bir hücre kullanabilirhücreleri toplamak için kazıyıcı.
5. 15 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu toplanır. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 900 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj.
6. jelatin ile kaplı 2 T12.5 şişelerinde endotelyal hücre büyüme ortamı ve plakanın 4 mL hücre pelletini yeniden askıya. 2 saat boyunca 37 ° C,% 5 _CO2 hücreleri inkübe edin.
7. orta yerine. % 90 konfluent - bunlar% 85 kadar, 37 ° C'de,% 5 _CO2 hücreleri inkübe edin.
8. 3 geçişleri - 2 sonra fare aort endotel hücreleri kullanır.

Fare aort endotel hücreleri 5. Karakterizasyonu

1. Yeniden plaka hücreleri.
   1. Kat jelatin (% 0.1) ile birlikte, 6 gözlü bir levha, 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. PBS ile plaka durulayın.
   2. Ön-ısıtma, yaklaşık 15 dakika boyunca 37 ° C'ye kadar Tripsin-EDTA ve steril PBS.
   3. Steril PBS ile 3 kez hücreleri yıkayın. hücrelere 0.5 tripsin mL / EDTA ekle, 37 ° C o de ~ 1 dakika boyunca inkübeHücrelerin çoğunda kadar r yuvarlak açın.
   4. sindirim durdurmak için endotelyal hücre büyüme ortamı 2 mL ekleyin. yukarı ve aşağı şişesi birkaç kez içinde hücre süspansiyonu pipetle. Gerekirse, hücreleri toplamak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
   5. 15 ml santrifüj tüpüne hücre süspansiyonu toplanır. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 900 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj.
   6. endotelyal hücre büyüme ortamı içinde hücrelerin yeniden askıya, süpernatant atılır. De, 3 x 10 ⁵ / yoğunluğunda jelatin ile kaplanmış 6-çukurlu plaka içindeki hücreleri tohumu.
   7. Hücreler, kültür yüzey eklemek için bir gece 37 ° C,% 5 _CO2 hücreleri inkübe edin.
2. Dil-ac-LDL bağlama -lectin Alınan ve Ulex.
   1. , 1,1-dioktadesil-3,3,3 'deposu 3'- tetramethylindo-karbosiyanin perklorat etiketli -20 ° C'de asetile LDL (Dil-Ac-LDL). boyama önce, buz üzerinde Dil-ac-LDL Çözülme. Stokta Dil-ac-LDL soluma / ml 1 mg'dır. 4 ° C'de FITC işaretli Ulex europaeus agglutinin (Ulex -Lectin, 1 ug / mL) saklayın. Hazır Ulex -Lectin Çözelti 1 mg / mL'dir. Mağaza 4 ° C'de Hoechst 33342. Hazır Hoechst 33342 çözeltisi, 100 ug / mL'dir.
   2. 10 ug / ml bir nihai konsantrasyon yapmak için kültür ortamı, 1 ml inceltilmiş-Ac-LDL stok solüsyonu 10 uL ekleyin.
   3. boyama öncesinde, eski orta çıkarın ve yeni ortam ile her bir hücrelerin yıkayın.
   4. Yeni orta çıkarın ve Dil-ac-LDL boyama orta ekleyin.
   5. 1 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 _CO2 hücreleri inkübe edin.
   6. Steril 1x PBS ile 3 kez hücreleri yıkayın.
   7. hücrelerin tespit edilmeleri için% 10 formalin 1 ml. yaklaşık 30 dakika boyunca oda sıcaklığında plaka koyun.
   8. Steril 1x PBS ile 3 kez hücreleri yıkayın. Işığı kaçının.
   9. Ulex -Lectin 10 uL içeren 1 ml steril 1 x PBS ekleyin.
   10. Oda temperatu hücreleri inkübe1 saat boyunca karanlıkta yeniden.
   11. Steril 1x PBS ile 3 kez hücreleri yıkayarak Ulex-lektin çıkarın.
   12. , 1 ug / ml nihai konsantrasyona kadar Hoechst 33342 ekleme karanlıkta 10 dakika inkübe edilir.
   13. Dil-Ac-LDL (kırmızı, 576 nm emisyon dalga boyu), Ulex -Lectin (yeşil, 519 nm emisyon dalga boyu) ve Hoechst floresan görüntüleme (mavi, 361 nm emisyon dalga boyu) bir ters flüoresan mikroskop ile.
3. CD31, VEGFR2'sinin, eNOS için Floresan boyama, VE-kaderin ve calponin.
   1. Mağaza FITC-konjüge anti-fare CD31 antikoru, eNOS antikoru, VE-cadherin 4 ° C'de antikoru FITC-konjuge anti-tavşan IgG karanlıkta. -20 ° C'de saklayın VEGFR2 antikoru.
   2. Steril 1x PBS ile 3 kez hücreleri yıkayın.
   3. hücrelerin tespit edilmeleri için% 10 formalin 1 ml. yaklaşık 30 dakika boyunca oda sıcaklığında plaka koyun.
   4. Steril 1x PBS ile 3 kez hücreleri yıkayın.
   5. CD31 leke için, 1 ml steril 1x ekleyinCD31-FITC antikoru 10 uL içeren PBS ile yıkandı. sırasıyla-VE Cadherin veya primer antikor calponin, leke ya VEGFR2, eNOS,-VE Cadherin veya calponin, VEGFR2'sinin, eNOS 4 mcL içeren steril 1x PBS 1 ml ekleyin.
   6. Karanlıkta 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe hücreleri.
   7. Steril PBS ile 3 kez hücreler yıkanarak antikor çıkarın.
   8. VEGFR2 boyanması için, eNOS, VE-cadherin ya calponin FITC-konjuge anti-tavşan IgG, 10 uL içeren steril 1 x 1 mL PBS ilave edin. Karanlıkta 1 saat boyunca buz üzerinde inkübe hücreleri. Steril PBS ile 3 kez hücreler yıkanarak IgG çıkarın.
   9. , 1 ug / ml nihai konsantrasyona kadar Hoechst 33342 ekleme karanlıkta 10 dakika inkübe edilir.
   10. CD31, VEGFR2, eNOS floresan görüntüleme VE-cadherin bir ters flüoresan mikroskop ile, calponin (yeşil, 518-535 nm emisyon dalga boyu) ve Hoechst (mavi, 361 nm emisyon dalga boyu).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Endotel Hücre Çimlenme

Spontan endotel hücre, bir fare aort segmentine başladı filizlenme. Fare aortu kademeli bir 4 gün boyunca endotelyal hücre büyüme ortamı içinde daha sonra bir büyüme faktörü azaltılmış matrisi üzerinde büyümeye bırakılmıştır. 4 gün - endotel hücre filizlenmekte genellikle 2 görünür. Fotomikrograflar, 4. günde (Şekil 1) üzerine çekildi. resimlerde gösterildiği gibi, çok sayıda endotel hücreleri uz...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışma, herhangi bir özel ekipman olmadan bir fare aort hücreleri izole ve kültür endotel için basit bir yöntemi gösterir. immünofloresan boyama hücrelerin çoğunluğu, ikinci geçiş sonra endotel hücreleri olduğunu göstermiştir. Üçüncü geçişine saniyede hücreleri, in vitro ve endotelyal biyolojisi okumak için in vivo deneyler uygun olduğu ileri sürülmektedir.

Mevcut Protokolü Önemli Notlar

pro...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
4- or 6-week-old mice	Jackson Laboratory	#000664
Sterile 1x phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	#10010-023
Sterile 1x PBS containing 1,000 U/mL of heparin	Sigma Aldrich	H3149
Endothelial cell growth medium (Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium [DMEM] with 25 mM HEPES [Gibco, #12320-032], supplemented with 100 μg/mL endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue [ECGS, Sigma, #2759], 10% fetal bovine serum [FBS, Gibco, #10082-147], 1,000 U/mL heparin [Sigma Aldrich, H3149], 10,000 U/mL penicillin and 10 mg/mL streptomycin [Gibco, #15140-122])
Growth factor reduced matrix	BD Biosciences	356231
Neutral proteinase (Dispase, 1 U/mL, Fisher Scientific, #CB-40235) and D-Val medium (D-Valine, 0.034 g/L, Sigma, #1255), in Dulbeccos’ Modified Eagle’s Medium, low glucose (Gibco, #12320-032)
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- tetramethylindo-carbocyanine perchlorate-labeled acetylated LDL (Dil-ac-LDL)	Life Technologies	L3484
FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin (Ulex-Lectin)	Sigma	L9006
Anti-mouse CD31-FITC conjugated antibody	BD Biosciences	553372
Anti-mouse vascular endothelial growth factor receptor 2 antibody	Cell Signaling	9698
Anti-mouse endothelial nitric oxide synthase	Abcam	ab5589
Anti-mouse vascular endothelium-cadherin	Abcam	33168
Anti-mouse calponin	Abcam	700
FITC-conjugated anti-rabbit IgG	Sigma	F6005
1 mL syringe fitted with 25-G needle	Fisher Scientific	50-900-04222
100 mm Peri dishes	Fisher Scientific	07-202-516
Six-well cell culture plates	Fisher Scientific	08-772-1B
T12.5 culture flask	Fisher Scientific	50-202-076
Scissors, forceps, microdissection scissors and forceps, Scalpel blade	Fine Science Tools, Inc.
Anesthesia machine with isoflurane	Webster Veterianary Supply	07-806-3204
heating lamp
Centrifuge machine
Inverted phase-contrast microscope
inverted fluorescence microscope