La diferenciación de la línea celular SH-SY5Y de neuroblastoma humano

Resumen

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Resumen

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introducción

La capacidad de utilizar en sistemas de modelos in vitro ha mejorado en gran medida el campo de la neurobiología y las neurociencias. Las células en cultivo proporcionan una plataforma eficiente para caracterizar la funcionalidad de las proteínas y los mecanismos moleculares subyacentes fenómenos específicos, para entender la patología de la enfermedad y la infección, y para realizar evaluaciones preliminares de análisis de drogas. En la neurobiología, los principales tipos de modelos de cultivo celular incluyen cultivos neuronales primarios derivados de ratas y ratones, y las líneas celulares de neuroblastoma, tales como células B35 de la rata ^5, Neuro-2A células de ratón ^6, y las células PC12 de rata ^7. Aunque el uso de tales líneas de células ha avanzado de manera significativa el campo, hay varios factores de confusión asociadas con la manipulación de las células y tejidos no humanos. Estos incluyen especies específicas de comprensión de las diferencias en los procesos metabólicos, fenotipos de manifestación de la enfermedad, y la patogénesis en comparación con los seres humanos. También es importante tener en cuenta que lare son diferencias significativas entre el ratón y la expresión de genes humanos y de señalización del factor de transcripción, destacando las limitaciones de los modelos de roedores y la importancia de comprender las vías que se conservan entre roedores y humanos ^8-11. Otros han empleado el uso de líneas de células neuronales humanas, incluyendo la N-Tera-2 (NT2) línea celular humana teratocarcinoma y células madre pluripotentes inducibles (CMPI). Estas líneas celulares proporcionan buenos modelos para sistemas humanos in vitro. Sin embargo, la diferenciación de las células NT2 con ácido retinoico (RA) da como resultado la generación de una población mixta de neuronas, astrocitos y células gliales radiales ^12, requiriendo una etapa de purificación adicional para obtener poblaciones puras de las neuronas. Además, las células NT2 demuestran un cariotipo muy variable ^13, con más de 60 cromosomas en 72% de las células. iPSCs demuestran la variabilidad en la diferenciación entre las diferentes líneas celulares y varían en la eficiencia de la diferenciación ^14. Por lo tanto, es deseable tener un modelo de célula neuronal humano consistente y reproducible para complementar estas alternativas.

células de neuroblastos-como SH-SY5Y son un subclón de la línea celular de neuroblastoma padres SK-N-SH. La línea celular parental se generó en 1970 a partir de una biopsia de médula ósea que contiene tanto células de tipo epitelial ¹⁵ neuroblastos-como y. células SH-SY5Y tienen un cariotipo estable que consta de 47 cromosomas, y se pueden diferenciar de un estado neuroblast-como en neuronas humanos maduros a través de una variedad de diferentes mecanismos que incluyen el uso de RA, ésteres de forbol, y neurotrofinas específicos, tales como derivados de cerebro factor neurotrófico (BDNF). Antes evidencia sugiere que el uso de diferentes métodos puede seleccionar para los subtipos de neuronas específicas, tales como adrenérgicos, colinérgicos, y las neuronas dopaminérgicas ^16,17. Este último aspecto hace que las células SH-SY5Y útiles para una multitud de experimentos neurobiología.

ONTENIDO "> Varios estudios han señalado importantes diferencias entre las células SH-SY5Y en sus estados no diferenciadas y diferenciadas. Cuando las células SH-SY5Y son indiferenciada, rápidamente proliferan y parecen ser no polarizado, con muy pocos procesos, cortos. A menudo crecen en grupos y expresar marcadores indicativos de las neuronas inmaduras ^18,19. Cuando diferenciadas, estas células se extienden largas, ramificado procesos, disminución en la proliferación y, en algunos casos polarizan ^2,18. SH-SY5Y células completamente diferenciadas se han demostrado previamente para expresar una variedad de diferentes marcadores de las neuronas maduras incluyendo la proteína asociada al crecimiento (GAP-43), los núcleos neuronales (NeuN), sinaptofisina (SYN), sináptica proteína de la vesícula II (SV2), enolasa neuronal específica (NSE) y la proteína asociada a microtúbulos (MAP) ^2,16,17,20, y carecer de la expresión de marcadores gliales tales como la proteína ácida glial fibrilar (GFAP) ^4. En apoyo que diferencian SH-SY5Y células represent una población neuronal homogénea, la eliminación de BDNF da como resultado la apoptosis celular ^4. Esto sugiere que la supervivencia de las células SH-SY5Y diferenciadas depende de factores tróficos, similares a neuronas maduras.

El uso de células SH-SY5Y se ha incrementado desde el subclón fue establecida en 1978 ^3. Algunos ejemplos de su uso incluyen la investigación de la enfermedad de Parkinson ^17, enfermedad de Alzheimer ^21, y la patogénesis de la infección viral, por ejemplo poliovirus ^22, el enterovirus 71 (EV71) ^23,24 , virus de la varicela-zoster (VZV) ^1, citomegalovirus humano ^25, y el virus de herpes simplex (HSV) ^2,26. Es importante tener en cuenta que varios estudios utilizando células SH-SY5Y han utilizado estas células en su forma no diferenciada, especialmente en el campo de la Neurovirology ^27-36. La diferencia en el fenotipo observado de no diferenciado frente a las células SH-SY5Y diferenciadas plantea la cuestión de wheTher la progresión observada de infección sería diferente en las neuronas diferenciadas maduras. Por ejemplo, células SH-SY5Y diferenciadas tienen una mayor eficiencia de HSV-1 absorción frente a, la proliferación de células SH-SY5Y diferenciadas, que pueden ser debido a la falta de receptores de superficie que se unen HSV y modulan la entrada en las células SH-SY5Y diferenciadas ^2. Por tanto, es fundamental que en el diseño de un experimento se centró en las pruebas de neuronas in vitro, las células SH-SY5Y se deben diferenciar el fin de obtener los resultados más precisos para la traducción y la comparación con los modelos in vivo.

El desarrollo de un método fiable para generar cultivos neuronales humanos es imprescindible para permitir a los investigadores realizar experimentos de traslación que modelan con precisión el sistema nervioso humano. El protocolo que se presenta aquí es un procedimiento que delinea mejores prácticas derivadas de los métodos anteriores ^1-4 para enriquecer en neuronas humanas que se diferencianutilizando ácido retinoico.

Protocolo

1. Consideraciones generales

1. Véase la Tabla de Materiales / Equipos para obtener una lista de los reactivos necesarios. Realizar todos los pasos bajo estrictas condiciones de asepsia.
2. Utilice suero bovino fetal inactivado por calor (hiFBS) para todas las preparaciones de medios de comunicación que incluyen FBS. Para calentar-inactivate, calentar una parte alícuota de 50 ml de FBS a 56 ° C durante 30 min, invirtiendo cada 10 min (véase también la Tabla 1).
   Nota: Cuando se utiliza sin FBS inactivación térmica, el fenotipo epitelial progresa más rápidamente a través de cultivos de células SH-SY5Y.
3. Antes de su uso, Deja que el material se caliente y se equilibran en una incubadora para establecer un equilibrio apropiado del pH antes de cada paso. Por ejemplo, a 50 ml de medio tarda aproximadamente una hora para equilibrar completamente (pH 7, 37 ° C, 5% de CO _2).
   Nota: Este protocolo utiliza un procedimiento de división de dos etapas que requiere células parcialmente diferenciadas SH-SY5Y que ser tratadas con tripsina y re-plateado. Este es un estresanteproceso para estas células excepcionalmente frágiles. Por lo tanto, es importante incubar las células en tripsina durante una cantidad de tiempo mínima. Esto permitirá el despegue preferencial de las neuronas, dejando a las células de tipo epitelial todavía unido al plato.
4. Realizar trituración de células diferenciadas lentamente con una pipeta de plástico de 10 ml con la punta contra la parte inferior del tubo cónico que contiene las células. Realizar trituración a una velocidad lenta, arriba y abajo de no más de cinco veces.

2. La aprobación de SH-SY5Y culturas mantenimiento

1. culturas mantenimiento de división cuando las células han alcanzado el 70-80% de confluencia, y no excedan de 10 a 15 pasajes. Culturas típicamente necesitan ser passaged cada 3-5 días (cultivos asumiendo no se diluyen más de 5 veces durante la división).
2. Para células pasaje de un matraz T-75, Aspirar los medios de comunicación, luego enjuague con aproximadamente 10 ml de PBS 1x.
   Nota: No se recomienda dividir el SH-SY5Y culturas mantenimiento further de 1: 5 durante los pases ya que esto puede causar que las células se mueren debido a la baja de confluencia.
3. Aspirar el PBS y, a continuación, añadir 2,5 ml de 0,05% tripsina-EDTA (1x).
4. Incubar en incubadora 2-3 min y la punta suavemente para liberar las células de la superficie del matraz.
5. Añadir 10 ml de crecimiento básico de los medios de comunicación (véase la Tabla 2) y se tritura 1-2 veces.
6. Centrifugar durante 2 minutos a 1.000 xg, medios de aspirado, a continuación, volver a suspender sedimento en 5 ml Crecimiento medios básicos.
7. Diluir las células de 1: 3 a 1: 5 en un volumen total de 20 ml para chapado normal en el matraz T-75, o contar y la placa para la diferenciación (sección 5).

3. La congelación de las células SH-SY5Y

1. Congelación de primeros pasajes de células de neuroblastoma SH-SY5Y en Básico Crecimiento medio suplementado con 5% (v / v) de DMSO.
2. Inicialmente, congelar alícuotas a -80 ° C durante 24 horas, luego se transfieren a nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.
   Nota: Para tener una referencia, un confluentes (75-85%) matraz T-75 producirá cincoAlícuotas de 1 ml de SH-SY5Y células para la congelación. Cada una de estas alícuotas debe contener de 2-5 millones de células totales.

4. Las células Descongelar y Cultura indiferenciado SH-SY5Y de neuroblastoma

1. Preparar crecimiento básico de los medios de comunicación.
2. Descongelar rápidamente las células congeladas en un baño de agua a 37 ° (aproximadamente 2 minutos).
3. Resuspender las células en 9 ml de Medios de Crecimiento básico en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar durante 2 minutos a 1.000 x g.
4. Aspirar el sobrenadante con cuidado de no molestar a las células sedimentadas, y las células suavemente resuspender en 10 ml Crecimiento medios básicos.
5. Células de la placa en un matraz T-25 o 60 mm ² plato.
6. Al día siguiente, en lugar de los medios de comunicación para eliminar las células muertas.

5. Día 0: placas células para la diferenciación

1. Véase la Figura 1 para el programa de diferenciación.
2. Enjuagar las células indiferenciadas con 1x PBS, aspirado, y luego trypsinize de 1-2 ml calentado1x 0,05% de tripsina-EDTA.
3. Cuando las células están en tripsina, se incuba durante aproximadamente 3 min en una incubadora.
4. Se inactiva la tripsina mediante la adición de 10 ml de crecimiento básico de los medios de comunicación, enjuagar los lados del matraz o un plato, y se tritura suavemente 1-3 veces. Transferir el contenido a un tubo cónico de 15 ml.
5. Centrifugar durante 2 minutos a 1.000 xg, y aspirar los medios de comunicación, teniendo cuidado de no perturbar el sedimento.
6. sedimento se vuelve a suspender en 5 ml de Medios de Crecimiento básico y triturar 1-3 veces.
7. Contar las células usando un hemocitómetro, y luego diluir con crecimiento básico de los medios de comunicación a 50.000 células / ml.
8. Placa de 2 ml de células por 35 mm ² plato para un total de 100.000 células por placa y se coloca de nuevo en la incubadora.

6. Día 1: Cambiar medios (Diferenciación de Medios # 1)

1. Alícuota de 50 ml de Diferenciación de Medios # 1 (ver Tabla 2) y se incuban en un baño de agua a 37 °.
2. Cuando se calienta medios de comunicación, permitir que se equilibre en una incubadora (37° C, 5% de CO ₂₎ para al menos una hora a establecer un equilibrio apropiado del pH antes de su uso.
3. Añadir ácido retinoico (RA) (ver Tabla 1) para calentar y los medios de comunicación equilibrada inmediatamente antes de la adición de los medios de comunicación a los platos.
   Nota: El ácido retinoico es sensible a la luz y debe ser almacenado en botellas oscuras a 4 ° C
4. Se aspira suavemente fuera de los medios tradicionales y desechar.
5. Añadir 2 ml Diferenciación de Medios # 1 con AR por 35 mm ² plato y volver a la incubadora.

7. Día 3: Cambiar medios (Diferenciación de Medios # 1)

1. Repita la sección 6 (pasos 1-5)

8. Día 5: Cambiar medios (Diferenciación de Medios # 1)

1. Repita la sección 6 (pasos 1-5)

9. Día 7: Dividir celdas 1: 1

1. Añadir a la AR se calentó y se equilibró Diferenciación de Medios # 1 inmediatamente antes de la adición de los medios de comunicación a los platos.
2. Se aspira suavemente fuera de los medios tradicionales y desechar.
3. Añadir 200 lcalentado 0,05% 1x Tripsina EDTA por 35 mm ² plato y caliente en incubadora aproximadamente 2-3 min o hasta que las células se levantan visiblemente de la placa tal como se observa bajo un microscopio.
4. Se inactiva la tripsina mediante la adición de 2 ml Diferenciación de Medios # 1 con AR por 35 mm ² plato y el uso de los medios de comunicación para enjuagar las células neuronales restante de la placa. A continuación, transferir el contenido a un tubo cónico de 50 ml.
   Nota: Durante tripsinización pasos, no trypsinize demasiados platos a la vez. Esto ayuda a asegurar cultivos neuronales no se incubaron en tripsina durante demasiado tiempo, que puede ser citotóxico.
5. Combine el contenido de hasta 10 platos en el tubo cónico de 50 ml y se tritura suavemente lentamente arriba y abajo no más de cinco veces con una pipeta de plástico de 10 ml.
6. Alícuota de suspensión celular de 2 ml en 35 mm frescas ² platos y volver a la incubadora.

10. Día 8: Cambio de Medios (Diferenciación de Medios # 2)

1. Añadir RA (ver Tabla 1) para calentar y se equilibró medios inmediatamente antes de la adición de los medios de comunicación a los platos.
2. Se aspira suavemente fuera de los medios tradicionales y desechar.
3. Poco a poco agregue 2 ml Diferenciación de Medios # 2 (véase la Tabla 2) con AR por 35 mm ² platos y retorno a la incubadora. No permitir que las neuronas que se exponen al aire durante un período prolongado de tiempo, ya que pueden secarse rápidamente.

11. Día 9: Preparar la matriz extracelular (ECM) placas revestidas

1. Descongelar un vial de solución ECM en hielo y se diluye 1: 100 en DMEM frío.
2. Dispensar 2 ml de mezcla en cada placa de 35 mm ² y asegúrese de toda la base de la cápsula está cubierta.
3. Colocar en una incubadora (37 ° C, 5% de CO ₂₎ durante 1 hora o durante la noche.
4. Aspirar mezcla y dejar secar al aire durante aproximadamente 1 hora en una campana. Almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de 2 meses.

12. Día 10: Las células de transferencia sobreLas placas recubiertas de ECM 1: 1

1. Añadir RA (véase la Tabla 1) a los medios de comunicación y calentado equilibrada inmediatamente antes de la adición de los medios de comunicación a los platos.
2. Se aspira suavemente fuera de los medios de comunicación y desechar.
3. Añadir 200 l calentado tripsina a cada placa de 35 mm ² y permitir incubar a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 a 2 min o hasta que las neuronas se levantan visiblemente desde el plato como se observa bajo un microscopio.
   Nota: Ejecutar este paso tripsinización a temperatura ambiente con el fin de no sobre-incubar las neuronas con tripsina y causar daños. Neuronas liberan a partir de placas mucho más rápido que las células de tipo epitelial en esta etapa.
4. Se inactiva la tripsina mediante la adición de 2 ml Diferenciación de Medios # 2 por 35 mm ² plato y utilizar los medios de comunicación para enjuagar las células neuronales restante de la placa. A continuación, transferir el contenido a un tubo cónico de 50 ml.
5. Combine el contenido de hasta 10 platos en el tubo cónico de 50 ml y se tritura suavemente lentamente arriba y abajo no más de cinco veces conuna pipeta de plástico de 10 ml.
6. Prescindir de 2 ml de suspensión celular en 35 mm ² platos recubiertos de ECM y de retorno a la incubadora.

13. Día 11: Cambio de Medios (Diferenciación de Medios # 3)

1. Añadir RA (véase la Tabla 1) a los medios de comunicación y calentado equilibrada inmediatamente antes de la adición de los medios de comunicación a los platos.
2. Se aspira suavemente fuera de los medios tradicionales y desechar.
3. Poco a poco agregue 2 ml Diferenciación de Medios # 3 (véase la Tabla 2) con AR por 35 mm ² plato y volver a la incubadora. No permitir que las neuronas que se exponen al aire durante un período prolongado de tiempo.

14. Día 14: Cambio de Medios (Diferenciación de Medios # 3)

1. Repita la sección 13 (pasos 1-3)

15. Día 17: último cambio de Medios (Diferenciación de Medios # 3)

1. Repita la sección 13 (pasos 1-3)

16. Día 18: cultivos neuronales listo para usar

1. Cambiar medios para Dif frescaerentiation Medios # 3 con AR cada 3 días para mantener la salud de las neuronas.
   Nota: Las celdas deben diferenciarse en neuronas y exhiben un fenotipo neuronal. Los cultivos son típicamente estables durante hasta 14 días después de la diferenciación terminal, sin embargo la duración de la viabilidad de las neuronas depende del número de pases de las células no diferenciadas en el inicio de la diferenciación. números de pases más altos producen neuronas diferenciadas con una vida útil más corta.

Resultados

En la actualidad, hay muchos casos en el campo de la neurobiología y Neurovirology donde se utilizan células SH-SY5Y diferenciadas como un modelo funcional para neuronas humanas ^27-36, y de manera importante, las células indiferenciadas pueden carecer de fenotipos tales como la absorción viral óptima ² que son necesaria para la correcta interpretación. Es fundamental que al utilizar células SH-SY5Y o cualquier otro sistema neuronal in vitro, las células se diferencian en neuronas a...

Discusión

El protocolo anterior proporciona un método sencillo y reproducible para generar cultivos neuronales humanos homogéneas y viables. Este protocolo utiliza técnicas y prácticas que se integran varios métodos publicados anteriormente ^{1-4 y} objetivos para delinear las mejores prácticas de cada uno. La diferenciación de las células SH-SY5Y se basa en la privación de suero gradual; la adición de ácido retinoico, factores neurotróficos y proteínas de la matriz extracelular; y la división de serie para ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Invitrogen	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10ug)/B3795 (5ug)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	-
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	-
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	-
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	-
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	-
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4° C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	-
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	-
Falcon 35mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	-