La différenciation de la SH-SY5Y neuroblastome humain Cell Line

Résumé

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

Résumé

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease.

The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods^1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

Introduction

La possibilité d'utiliser dans des systèmes modèles in vitro a grandement amélioré les domaines de la neurobiologie et les neurosciences. Cellules en culture constituent une plate-forme efficace pour caractériser la fonctionnalité des protéines et des mécanismes moléculaires spécifiques phénomènes sous-jacents, de comprendre la pathologie de la maladie et l'infection, et d'effectuer des évaluations préliminaires de dépistage de drogues. En neurobiologie, les principaux types de modèles de culture de cellules comprennent des cultures de neurones primaires dérivées de rat et la souris, et des lignées cellulaires de neuroblastome comme les cellules B35 de rat ^5, des cellules de souris Neuro-2A ^6, et les cellules PC12 de rat ^7. Bien que l'utilisation de telles lignées cellulaires a progressé de façon significative le champ, il existe plusieurs facteurs de confusion liés à la manipulation des cellules non humaines et des tissus. Ceux-ci comprennent la compréhension spécifiques aux espèces différences dans les processus métaboliques, les phénotypes de la manifestation de la maladie, et la pathogenèse par rapport à l'homme. Il est également important de noter que lere des différences significatives entre la souris et l'expression de gènes humains et de la signalisation du facteur de transcription, en soulignant les limites des modèles de rongeurs et l'importance de comprendre quelles voies sont conservées entre les rongeurs et les humains ^8-11. D'autres ont eu recours à l'utilisation de lignées de cellules neuronales humaines, y compris la N-Tera-2 (NT2) de lignée humaine de cellules de tératocarcinome et cellules souches pluripotentes inductibles (CSPi). Ces lignées cellulaires sont de bons modèles pour systèmes humains in vitro. Toutefois, la différenciation des cellules NT2 avec de l'acide rétinoïque (RA) a pour résultat la génération d'une population mixte de neurones, les astrocytes et les cellules gliales radiales ^12, ce qui nécessite une étape de purification supplémentaire afin d'obtenir des populations pures de neurones. En outre, les cellules NT2 montrent un caryotype très variable ^13, avec plus de 60% ​​en 72 chromosomes des cellules. iPSCs montrent la variabilité dans la différenciation entre les différentes lignées cellulaires et de modification de l'efficacité de la différenciation ^14. Il est donc souhaitable de disposer d'un modèle cellulaire neuronale humaine constante et reproductible pour compléter ces alternatives.

cellules neuroblastes comme SH-SY5Y sont un sous-clone de la lignée de cellules de neuroblastome parentale SK-N-SH. La lignée cellulaire parentale a été généré en 1970 à partir d'une biopsie de la moelle osseuse qui contient à la fois neuroblastes-like et les cellules épithéliales de type ^15. SH-SY5Y ont un caryotype stable constitué de 47 chromosomes, et peuvent être différenciés d'un état dans les neurones humains matures neuroblastes comme à travers une variété de mécanismes, y compris l'utilisation de la PR, les esters de phorbol et neurotrophines spécifiques tels que les brain-derived facteur neurotrophique (BDNF). Avant preuve suggère que l'utilisation de différentes méthodes peut sélectionner des sous-types spécifiques de neurones adrénergiques tels que, cholinergiques et des neurones dopaminergiques ^16,17. Ce dernier aspect fait SH-SY5Y utiles pour une multitude d'expériences de la neurobiologie.

ontenu "> Plusieurs études ont noté des différences importantes entre les cellules SH-SY5Y dans leurs états indifférenciées et différenciées. Lorsque les cellules SH-SY5Y sont indifférenciées, elles prolifèrent rapidement et semblent être non polarisée, avec très peu, des processus courts. Ils poussent souvent en touffes et d'exprimer des marqueurs indicatifs de neurones immatures ^18,19. Lorsque différencié, ces cellules étendent longs processus ramifié, diminution de la prolifération et, dans certains cas polarisent ^2,18. SH-SY5Y différenciées ont été entièrement précédemment démontré pour exprimer une variété de différents marqueurs de neurones matures, y compris des protéines de croissance associé (GAP-43), les noyaux neuronaux (NeuN), la synaptophysine (SYN), synaptique protéine vésiculaire II (SV2), neurone énolase spécifique (NSE) et la protéine associée aux microtubules (MAP) ^2,16,17,20 et à l'absence d'expression de marqueurs gliales telles que protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) ^4. En outre soutien qui différencient SH-SY5Y represent une population neuronale homogène, l'enlèvement de BDNF se traduit par l'apoptose cellulaire ^4. Ceci suggère que la survie des cellules SH-SY5Y différenciées dépend de facteurs trophiques, semblables à des neurones matures.

L'utilisation de cellules SH-SY5Y a augmenté depuis le sous-clone a été créé en 1978 ^3. Quelques exemples de leur utilisation comprennent l'investigation de la maladie de Parkinson ^17, la maladie d'Alzheimer ^21, et la pathogenèse de l'infection virale dont poliovirus ^22, l'entérovirus 71 (EV71) ^23,24 , le virus varicelle-zona (VZV), ^{1, 25} cytomégalovirus humain et le virus de l'herpès simplex (HSV) ^2,26. Il est important de noter que plusieurs études utilisant des cellules SH-SY5Y ont utilisé ces cellules dans leur forme indifférenciée, en particulier dans le domaine de la neurovirologie ^27-36. La différence dans le phénotype observé des indifférenciée par rapport aux cellules SH-SY5Y différenciées soulève la question de whether la progression observée de l'infection serait différent dans les neurones différenciés matures. Par exemple, des cellules SH-SY5Y différenciées ont une plus grande efficacité de HSV-1 absorption en fonction, la prolifération des cellules SH-SY5Y indifférenciées, qui peuvent être dus à un manque de récepteurs de surface qui se lient HSV et modulent entrée sur les cellules SH-SY5Y indifférenciées ^2. Il est donc essentiel que lors de la conception d'une expérience axé sur les essais neurones in vitro, les cellules SH-SY5Y devraient être différenciés afin d'obtenir les résultats les plus précis pour la traduction et la comparaison avec des modèles in vivo.

Le développement d'une méthode fiable pour générer des cultures de neurones humains est impératif de permettre aux chercheurs de réaliser des expériences traductionnelles modéliser avec précision le système nerveux humain. Le protocole présenté ici est une procédure qui définit les meilleures pratiques issues de méthodes précédentes ^1-4 pour enrichir les neurones humains qui se différencientavec de l'acide rétinoïque.

Protocole

1. Considérations générales

1. Voir la Table des Matières / Équipement pour la liste des réactifs nécessaires. Effectuez toutes les étapes dans des conditions aseptiques strictes.
2. Utiliser du sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (hiFBS) pour toutes les préparations de médias qui incluent FBS. Pour chauffer inactiver, chauffer 50 ml aliquote de FBS à 56 ° C pendant 30 min, en inversant toutes les 10 min (voir également le tableau 1).
   Remarque: Lors de FBS est utilisé sans inactivation par la chaleur, le phénotype de type epithelial progresse plus rapidement dans des cultures de cellules SH-SY5Y.
3. Avant utilisation, laisser le matériau chaleureux et équilibrent dans un incubateur à établir un bon équilibre du pH avant chaque étape. Par exemple, 50 ml de milieu prend environ une heure pour équilibrer complètement (pH 7, 37 ° C, 5% CO _2).
   Remarque: Ce protocole utilise un mode opératoire de séparation en deux étapes qui nécessite SH-SY5Y différenciées partiellement être trypsinisées et re-plaquées. Ceci est un stressprocessus pour ces cellules exceptionnellement fragiles. Par conséquent, il est important de faire incuber les cellules à la trypsine pour un minimum de temps. Cela permettra à l'envol préférentiel de neurones, en laissant les cellules épithéliales comme encore attachés à l'antenne.
4. Effectuer une trituration de cellules différenciées lentement avec une pipette en matière plastique de 10 ml avec la pointe contre le fond du tube conique contenant les cellules. Effectuer trituration à une vitesse lente, de haut en bas pas plus de cinq fois.

2. Passage des cultures de maintenance SH-SY5Y

1. cultures de maintenance cassés lorsque les cellules ont atteint 70-80% de confluence, et ne pas dépasser 10 à 15 passages. Cultures doivent généralement être passées tous les 3-5 jours (en supposant cultures ne sont pas dilués plus de 5 fois pendant le fendage).
2. Pour les cellules de passage à partir d'un flacon T-75, aspirer hors médias, puis rincer avec environ 10 ml de PBS 1X.
   Remarque: Nous ne recommandons pas diviser le SH-SY5Y cultures de maintenance fucomplémen taires de 1: 5 au cours des passages, car cela peut provoquer la mort des cellules en raison du faible confluence.
3. Aspirer PBS, puis ajouter 2,5 ml de 0,05% de trypsine-EDTA (1x).
4. Incuber dans un incubateur 2-3 min et doucement basculer pour libérer les cellules de la surface du ballon.
5. Ajouter 10 ml de croissance de base des médias (voir le tableau 2) et triturer 1-2 fois.
6. Isoler pendant 2 min à 1000 xg, les médias aspirer, puis remettre le culot dans 5 ml de base de croissance des médias.
7. Diluer les cellules de 1: 3 à 1: 5 dans un volume total de 20 ml pour le placage normal dans flacon T-75, ou de compter et de la plaque de différenciation (section 5).

3. congélation de cellules SH-SY5Y

1. Congeler premiers passages des cellules de neuroblastome SH-SY5Y de croissance multimédia de base supplémenté avec 5% (v / v) de DMSO.
2. Initialement, geler aliquotes à -80 ° C pendant 24 heures, puis transfert à l'azote liquide pour le stockage à long terme.
   Remarque: Pour référence, une confluence (75-85%) flacon T-75 donnera cinqAliquotes de 1 ml de cellules SH-SY5Y de gel. Chacun de ces aliquotes devraient contenir de 2-5 millions de cellules totales.

4. Les cellules Décongeler et Culture indifférencié SH-SY5Y neuroblastome

1. Préparer la croissance multimédia de base.
2. Décongeler rapidement les cellules congelées dans un bain d'eau à 37 C ° à (environ 2 minutes).
3. Resuspendre les cellules dans 9 ml de base de croissance des médias dans un tube conique de 15 ml et centrifuger ensuite pendant 2 min à 1000 x g.
4. Aspirer le surnageant tout en faisant attention à ne pas perturber le culot cellulaire et les cellules doucement remettre en suspension dans 10 ml de base de croissance des médias.
5. Cellules de plaque sur un flacon T-25 ou un plat de 60 mm ^2.
6. Le lendemain, remplacer médias pour éliminer les cellules mortes.

5. Jour 0: étalement des cellules de différenciation

1. Voir Figure 1 pour le calendrier de la différenciation.
2. Rincer cellules indifférenciées avec 1x PBS, aspirer, puis trypsiniser avec 1-2 ml réchauffé1x 0,05% de trypsine-EDTA.
3. Lorsque les cellules sont la trypsine, incuber pendant environ 3 min dans un incubateur.
4. Étancher la trypsine en ajoutant 10 ml de croissance avec les médias de base, rincer les parois du ballon ou un plat, et triturer doucement 1-3 fois. Transférer le contenu dans un tube conique de 15 ml.
5. Centrifuger 2 min à 1000 x g, et aspirer les médias, tout en faisant attention de ne pas perturber le culot.
6. Remettre le culot dans 5 ml de base de croissance des médias et triturer 1-3 fois.
7. Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre, puis diluer en utilisant croissance multimédia de base de 50.000 cellules / ml.
8. Plate 2 ml de cellules par 35 mm ² plat pour un total de 100.000 cellules par boîte et placer de nouveau dans l'incubateur.

6. Jour 1: Changer le média (différenciation des médias n ° 1)

1. Aliquotes de 50 ml de différenciation média N ° 1 (voir le tableau 2) et incuber dans un bain-marie à 37 °.
2. Lorsque le média est réchauffé, le laisser se stabiliser dans un incubateur (37° C, 5% CO ₂₎ pendant au moins une heure d'établir un bon équilibre du pH avant de l'utiliser.
3. Ajouter de l'acide rétinoïque (AR) (voir tableau 1) pour réchauffer et médiatique équilibrée immédiatement avant ajout de médias aux plats.
   Remarque: L'acide rétinoïque est sensible à la lumière et doit être stocké dans des bouteilles foncées à 4 ° C
4. aspirer délicatement les anciens médias et le jeter.
5. Ajouter 2 ml différenciation médias n ° 1 à la PR par 35 mm ² plat et revenir à l'incubateur.

7. Jour 3: Changer le média (différenciation des médias n ° 1)

1. Répétez la section 6 (étapes 1-5)

8. Jour 5: Changer le média (différenciation des médias n ° 1)

1. Répétez la section 6 (étapes 1-5)

9. Jour 7: diviser les cellules 1: 1

1. Ajouter à RA réchauffé et équilibré différenciation médias n ° 1 juste avant ajout de médias aux plats.
2. aspirer délicatement les anciens médias et le jeter.
3. Ajouter 200 ulréchauffé 0,05% 1x trypsine EDTA par 35 mm ² plat et chaud dans l'incubateur d'environ 2-3 min ou jusqu'à ce que les cellules sont visiblement soulevé de la plaque, comme observé au microscope.
4. Étancher la trypsine en ajoutant 2 ml différenciation médias n ° 1 à la PR par 35 mm ² plat et utiliser les médias pour rincer restant cellules neuronales de la plaque. Puis transférer le contenu dans un tube conique de 50 ml.
   Remarque: Au cours de trypsinisation étapes, ne trypsiniser trop de plats à la fois. Cela permet d'assurer des cultures de neurones ne sont pas mises en incubation dans de la trypsine pendant trop longtemps, ce qui peut être cytotoxique.
5. Mélanger le contenu d'un maximum de 10 petits plats dans les 50 ml tube conique et triturer doucement lentement de haut en bas pas plus de cinq fois avec une pipette de 10 ml en plastique.
6. Aliquote de 2 ml de suspension cellulaire en frais 35 mm ² plats et revenir à l'incubateur.

10. Jour 8: Changer le média (différenciation des médias n ° 2)

1. Ajouter RA (voir Tableau 1) réchauffé et les médias équilibrée immédiatement avant ajout de médias aux plats.
2. aspirer délicatement les anciens médias et le jeter.
3. Lentement, ajouter 2 mL différenciation médias n ° 2 (voir le tableau 2) avec RA par 35 mm ² plat et retour à l'incubateur. Ne laissez pas les neurones d'être exposés à l'air pendant une longue période de temps, car ils peuvent sécher rapidement.

11. Jour 9: Préparer la matrice extracellulaire (ECM) boîtes recouvertes

1. Décongeler un flacon de solution ECM sur la glace et dilué 1: 100 dans DMEM froid.
2. Distribuer 2 ml de mélange dans chaque 35 mm ² plat et d'assurer la totalité de la base de la boîte est recouverte.
3. Placer dans un incubateur (37 ° C, 5% CO ₂₎ pendant 1 heure ou pendant une nuit.
4. mélange Aspirer et laisser sécher à l'air pendant environ 1 h dans une hotte. Stocker à température ambiante pendant jusqu'à 2 mois.

12. Jour 10: Les cellules de transfert surECM plaques revêtues 1: 1

1. Ajouter RA (voir le tableau 1) réchauffé et les médias équilibrée immédiatement avant ajout de médias aux plats.
2. aspirer délicatement les médias et le jeter.
3. Ajouter 200 pi de trypsine chauffées à chaque 35 mm ² plat et laisser incuber à la température ambiante pendant environ 1-2 minutes, ou jusqu'à ce que les neurones sont visiblement levée de l'antenne comme on l'observe sous un microscope.
   Remarque: Exécutez cette étape de traitement à la trypsine à la température ambiante de manière à ne pas trop incuber neurones avec de la trypsine et de causer des dommages. Neurones libèrent des plaques beaucoup plus rapidement que les cellules épithéliales de type à ce stade.
4. Étancher la trypsine en ajoutant 2 ml différenciation médias n ° 2 par 35 mm ² plat et d'utiliser les médias pour rincer restant cellules neuronales de la plaque. Puis transférer le contenu dans un tube conique de 50 ml.
5. Mélanger le contenu d'un maximum de 10 petits plats dans les 50 ml tube conique et triturer doucement lentement de haut en bas pas plus de cinq fois avecune pipette en matière plastique de 10 ml.
6. Distribuer 2 ml de suspension cellulaire en 35 mm ² plats ECM-enduit et revenir à l'incubateur.

13. Jour 11: Changer le média (différenciation des médias n ° 3)

1. Ajouter RA (voir le tableau 1) réchauffé et les médias équilibrée immédiatement avant ajout de médias aux plats.
2. aspirer délicatement les anciens médias et le jeter.
3. Lentement, ajouter 2 ml différenciation médias n ° 3 (voir le tableau 2) avec RA par 35 mm ² plat et revenir à l'incubateur. Ne pas permettre neurones d'être exposés à l'air pendant une période de temps prolongée.

14. Jour 14: Changer le média (différenciation des médias n ° 3)

1. Répétez l'article 13 (étapes 1-3)

15. Jour 17: Dernier médias Change (différenciation des médias n ° 3)

1. Répétez l'article 13 (étapes 1-3)

16. Jour 18: cultures de neurones prêt à l'emploi

1. Changer de support pour frais Différentiation médias n ° 3 avec RA tous les 3 jours pour maintenir la santé des neurones.
   Remarque: Les cellules doivent être différenciées en neurones et présentent un phénotype neuronal. Les cultures sont généralement stables pendant jusqu'à 14 jours après la différenciation terminale, mais la durée de la viabilité neuronale est fonction du nombre de passage de cellules indifférenciées au début de la différenciation. Un plus grand nombre de passage donnent neurones différenciés avec une durée de vie utile plus courte.

Résultats

À l'heure actuelle, il existe de nombreux cas dans le domaine de la neurobiologie et neurovirologie où SH-SY5Y indifférenciées sont utilisés comme un modèle fonctionnel pour les neurones humains ^27-36, et surtout, des cellules indifférenciées peuvent manquer phénotypes tels que optimale absorption virale ² qui sont nécessaire pour une interprétation précise. Il est essentiel que l'utilisation de cellules SH-SY5Y ou tout autre système neuronale in vitro, les cellules se...

Discussion

Le protocole ci-dessus fournit une méthode simple et reproductible pour produire des cultures de neurones humains homogènes et viables. Ce protocole utilise des techniques et des pratiques qui intègrent plusieurs méthodes publiées antérieurement ^{1-4 et} a pour objectif de définir les meilleures pratiques de chacun. La différenciation des cellules SH-SY5Y repose sur la privation de sérum progressive; l'addition de l'acide rétinoïque, les facteurs neurotrophiques et les protéines de la matric...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	ThermoFisher Scientific	17504-044	See Table 1 for preparation
Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF)	Sigma	SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg)	See Table 1 for preparation
dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP)	Sigma	D0627	See Table 1 for preparation
DMSO	ATCC	4-X	-
Minimum Essential Medium Eagle (EMEM)	Sigma	M5650	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03	See Table 1 for preparation
GlutamaxI	Life Technologies	35050-061	-
Glutamine	Hyclone	SH30034.01	-
Potassium Chloride (KCl)	Fisher Scientific	BP366-1	See Table 1 for preparation
MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution	Sigma	E0282	See step 11 of the protocol
Neurobasal	Life Technologies	21103-049	-
Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep)	Life Technologies	15140-122	-
Retinoic acid (RA)	Sigma	R2625	Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive
SH-SY5Y Cells	ATCC	CRL-2266	-
0.5% Trypsin + EDTA	Life Technologies	15400-054	-
Falcon 35 mm TC dishes	Falcon (A Corning Brand)	353001	-